GDF-15對(duì)Treg細(xì)胞分化和功能的影響.pdf

1、目的:近年來(lái),有研究表明GDF-15可以誘導(dǎo)外周單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)中Foxp3轉(zhuǎn)錄水平的的增加,Foxp3是調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)的標(biāo)志性分子,那么GDF-15對(duì)Tregs分化發(fā)育及功能有何影響呢?因此本研究擬探討GDF-15在體外誘導(dǎo)人Na?veCD4+T細(xì)胞向Tregs分化過(guò)程中的作用及其影響;通過(guò)臨床樣本觀察結(jié)直腸癌患者外周血CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例和血清中GDF-15表達(dá)水平的相關(guān)性;初步探討GDF

2、-15在iTregs分化中的分子作用機(jī)制。
　　方法:本課題設(shè)計(jì)了以下三個(gè)方面實(shí)驗(yàn):1、GDF-15誘導(dǎo)iTregs分化及其功能的鑒定。通過(guò)采取免疫磁珠法分選NaveCD4+T細(xì)胞,經(jīng)GDF-15刺激后,通過(guò)Real-timePCR、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)標(biāo)志性分子Foxp3、CD25,GITR,CD103等的表達(dá),通過(guò)Real-timePCR、ELISA檢測(cè)抑制性細(xì)胞因子IL-10和TGF-β等的分泌從而鑒定GDF-15誘導(dǎo)的iTreg

3、s表型,進(jìn)一步用BrdU摻入和CFSE檢測(cè)誘導(dǎo)的iTregs對(duì)效應(yīng)CD4+T細(xì)胞增殖的影響,同時(shí)收集培養(yǎng)細(xì)胞上清用ELISA檢測(cè)誘導(dǎo)的iTregs分泌的功能相關(guān)細(xì)胞因子IL-10和TGF-β等。2、收集臨床標(biāo)本,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例以及ELISA檢測(cè)血清中GDF-15濃度,進(jìn)而分析兩者相關(guān)性;3、GDF-15在iTregs分化中的分子作用機(jī)制研究。利用激光共聚焦實(shí)驗(yàn)觀察GDF-15在NaveC

4、D4+T細(xì)胞膜表面的表達(dá)情況,進(jìn)一步用TGF-β受體阻斷劑阻斷后,Real-timePCR檢測(cè)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平。
　　結(jié)果:第一部分GDF-15誘導(dǎo)iTregs分化及其功能的鑒定的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示GDF-15能誘導(dǎo)NaveCD4+T細(xì)胞向iTregs表型分化,且在GDF-15濃度為10ng/mL誘導(dǎo)5天時(shí)Foxp3的表達(dá)量最高,Real-timePCR和流式細(xì)胞術(shù)顯示iTregs的相關(guān)功能分子如Foxp3、CD25、GITR和CD1

5、03均表達(dá)升高。在進(jìn)行相關(guān)功能檢測(cè)中,Real-timePCR和ELISA實(shí)驗(yàn)顯示iTregs可以分泌功能相關(guān)的抑制性細(xì)胞因子IL-10和TGF-β,BrdU摻入和CFSE實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)誘導(dǎo)的iTregs具有抑制效應(yīng)CD4+T細(xì)胞增殖的作用。第二部分臨床實(shí)驗(yàn)通過(guò)SPSS13.0分析表明結(jié)直腸癌患者外周CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞與血清中GDF-15表達(dá)水平兩者之間具有良好的相關(guān)性,相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.7909。第三部分GD

6、F-15在iTregs分化中的分子作用機(jī)制的實(shí)驗(yàn)中,通過(guò)激光共聚焦檢測(cè)發(fā)現(xiàn),GDF-15在NaveCD4+T細(xì)胞膜表面存在定位現(xiàn)象,Real-timePCR結(jié)果顯示TGF-β受體阻斷劑SB431542可以抑制GDF-15誘導(dǎo)NaveCD4+T分化過(guò)程中Foxp3的表達(dá)。
　　結(jié)論:GDF-15可以在體外誘導(dǎo)NaveCD4+T細(xì)胞向調(diào)節(jié)性T細(xì)胞方向分化,同時(shí)表現(xiàn)出天然調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的表型和抑制功能;臨床上結(jié)直腸癌患者外周CD4+CD2