ADAMTS9基因?qū)Χ喟l(fā)性骨髓瘤作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的:多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是漿細(xì)胞惡性增殖性疾病，在血液腫瘤疾病中發(fā)病率較高。目前MM的發(fā)病機(jī)制仍不清楚，臨床治療十分困難。眾多研究表明表觀遺傳學(xué)的調(diào)節(jié)失衡與MM的發(fā)生具有密切關(guān)系。ADAMTS9(a disintegrin-like andmetallopeptidase with thrombospondin type1 motif,9)為ADAMTS家族成員之一，有研究證實(shí)ADAMTS9參與了腫瘤

2、的發(fā)生和發(fā)展。本研究旨在觀察MM中ADAMTS9基因表達(dá)及其啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)，以及ADAMTS9對(duì)MM生物學(xué)行為的影響，探討該基因在MM發(fā)病機(jī)制中的作用。
　　方法:
　　1.應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)觀察MM細(xì)胞系RPMI-8226、KM3，MM患者及正常人骨髓樣本ADAMTS9 mRNA的表達(dá)。
　　2.運(yùn)用甲基化特異性PCR(methylation-specific PCR，MSP)研究RPMI-8

3、226、KM3及MM患者骨髓樣本中ADAMTS9基因啟動(dòng)子甲基化狀況，正常人骨髓樣本為對(duì)照。并分析MM患者臨床資料與 ADAMTS9啟動(dòng)子甲基化有無相關(guān)性。
　　3.體外培養(yǎng)KM3細(xì)胞，用去甲基化藥物5-氮雜-2'-脫氧胞苷(5-aza-2'-deoxycytidine，Aza)聯(lián)合組蛋白去乙酰化酶抑制劑曲古菌素A(trichostatinA，TSA)處理，采用RT-PCR及MSP分別檢測(cè)KM3細(xì)胞在藥物干預(yù)前后ADAMTS9 m

4、RNA表達(dá)及甲基化狀態(tài)有無變化。
　　4.構(gòu)建ADAMTS9表達(dá)載體pCEP4-ADAMTS9及空載體pCEP4，轉(zhuǎn)染KM3細(xì)胞，以最小致死濃度G418篩選單克隆表達(dá)ADAMTS9的細(xì)胞，RT-PCR觀察驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果。
　　5.通過細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)，Cell Counting Kit-8(CCK-8)實(shí)驗(yàn)及流式細(xì)胞分析觀察KM3細(xì)胞在轉(zhuǎn)染ADAMTS9前后生物學(xué)行為的變化。
　　結(jié)果:
　　1.ADAMTS9在R

5、PMI-8226表達(dá)，而在KM3細(xì)胞表達(dá)缺失;MM患者和正常人骨髓樣本中ADAMTS9表達(dá)率分別為0％(0/15)、100％(15/15)。
　　2.RPMI-8226細(xì)胞ADAMTS9啟動(dòng)子未見甲基化，KM3細(xì)胞該基因啟動(dòng)子則高度甲基化。MM患者和正常人骨髓樣本中ADAMTS9基因啟動(dòng)子甲基化率分別為66％(37/56)、0％(0/15)。
　　3.ADAMTS9啟動(dòng)子甲基化與MM患者的年齡、性別、類型等臨床特征均未見顯著

6、相關(guān)性(P＞0.05)。
　　4.MM細(xì)胞經(jīng)去甲基化藥物處理后，ADAMTS9恢復(fù)表達(dá)，其甲基化特異性條帶減弱;而RPMI-8226細(xì)胞該基因表達(dá)在藥物處理前后無明顯變化。
　　5.ADAMTS9質(zhì)?？沙晒D(zhuǎn)染KM3細(xì)胞。ADAMTS9表達(dá)陽性的KM3細(xì)胞克隆形成減少，細(xì)胞阻滯于S期，細(xì)胞增殖受抑(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.ADAMTS9基因在KM3細(xì)胞和MM患者骨髓樣本中表達(dá)缺失，RPMI-8226