職業(yè)有害因素暴露致神經(jīng)細(xì)胞線粒體氧化損傷及防護(hù)策略探討.pdf

1、線粒體功能障礙(mitochondrial dysfunction),包括氧化磷酸化異常、能量代謝障礙、線粒體氧化應(yīng)激及線粒體DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)氧化損傷,是導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)諸多疾病發(fā)生和發(fā)展的重要病因。電磁輻射和含鎳材料的廣泛運(yùn)用在給生產(chǎn)生活帶來便利的同時(shí),所引發(fā)的環(huán)境污染和健康危害日益受到人們的關(guān)注。中樞神經(jīng)系統(tǒng)是電磁輻射暴露和鎳損傷的主要靶器官?；诰€粒體功能障礙在諸多中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的重要作用,

2、本研究以線粒體為靶細(xì)胞器,探討電磁輻射和鎳暴露致神經(jīng)細(xì)胞損傷的機(jī)制,并尋找相應(yīng)的生物學(xué)防護(hù)措施。實(shí)驗(yàn)中,我們以原代培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元、人源性的神經(jīng)母瘤SH-SY5Y細(xì)胞和小鼠神經(jīng)母瘤Neuro2a細(xì)胞為研究模型,將其暴露于1800MHz射頻段電磁輻射和不同濃度的氯化鎳(NiCl2)中,做了如下兩部分的實(shí)驗(yàn):
　　 一、電磁輻射對(duì)神經(jīng)細(xì)胞線粒體的氧化損傷及Tfam的保護(hù)作用
　　 (一)電磁輻射輻照對(duì)皮層神經(jīng)元線粒體的氧化損

3、傷
　　 電磁輻射輻照后6h、12h、24h和48h,皮層神經(jīng)元內(nèi)活性氧ROS水平顯著升高,細(xì)胞活性顯著降低,ATP含量和線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential,△Ψm)明顯下降。而且線粒體內(nèi)8-羥基脫氧鳥苷(8-hydroxy-2-deoxy-guanosine,8-OHdG)含量顯著升高,而mtDNA拷貝數(shù)和mtDNA編碼基因(ND1、COX I和ND6)mRNA水平顯著下降。提示電磁

4、輻射輻照對(duì)皮層神經(jīng)元線粒體造成明顯的氧化損傷。
　　 (二)電磁輻射輻照對(duì)皮層神經(jīng)元。Tfam表達(dá)、轉(zhuǎn)運(yùn)和結(jié)合mtDNA活性的影響
　　 資料顯示,導(dǎo)致線粒體功能障礙的原因很多,而mtDNA突變是其中最為重要的因素。Tfam是維持mtDNA完整性和線粒體功能的核心因子。在多種病理生理過程中,氧化應(yīng)激可以通過影響Tfam的表達(dá)或活性導(dǎo)致線粒體功能障礙和細(xì)胞的氧化損傷。所以本部分研究從Tfam作用通路的角度,探討電磁輻射致神

5、經(jīng)細(xì)胞線粒體功能障礙的可能的生物學(xué)機(jī)制。結(jié)果表明,電磁輻射輻照后,皮層神經(jīng)元內(nèi)Tfam mRNA和蛋白的表達(dá)顯著性升高。轉(zhuǎn)運(yùn)分析(import assay)實(shí)驗(yàn)顯示皮層神經(jīng)元線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)體外表達(dá)的S35-Tfam蛋白的效率明顯降低。凝膠遷移實(shí)驗(yàn)(EMSA)也表明線粒體內(nèi)Tfam與mtDNA輕鏈啟動(dòng)子結(jié)合顯著降低。表明電磁輻射輻照抑制了Tfam的轉(zhuǎn)運(yùn),對(duì)線粒體內(nèi)Tram與mtDNA結(jié)合有影響。提示電磁輻射可能是通過抑制Tfam轉(zhuǎn)運(yùn)來造成神經(jīng)

6、細(xì)胞線粒體損傷的。
　　 (三)Tfam過表達(dá)在電磁輻射致SH-SY5Y細(xì)胞線粒體損傷中的保護(hù)作用
　　 1.成功構(gòu)建Tfam表達(dá)質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細(xì)胞。電磁輻射輻照后24h,Tram過表達(dá)能顯著降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平,減輕電磁輻射對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞活性的損傷,提高ATP含量,有效緩解電磁輻射輻照引起的SH-SY5Y細(xì)胞線粒體內(nèi)8-OHdG含量的升高,維持mtDNA拷貝數(shù)和mtDNA編碼基因(ND1、COX I和N

7、D6)mRNA水平。提示Tram過表達(dá)能有效改善電磁輻射輻照所致的神經(jīng)細(xì)胞線粒體氧化損傷。
　　 2.敲除Tfam蛋白中具有轉(zhuǎn)錄活性的C末端,保留其維持mtDNA核樣結(jié)構(gòu)和mtDNA拷貝數(shù)的功能。電磁輻射輻照后24h,C末端缺失的Tfam(△C-Tfam),同野生型Tfam一樣,能顯著降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平,減輕電磁輻射對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞細(xì)胞活性的損傷,提高ATP含量,有效緩解電磁輻射輻照引起的SH-SY5Y細(xì)胞mtDNA的氧化

8、損傷。提示Tfam拮抗電磁輻射致線粒體氧化損傷的機(jī)制與Tfam維持mtDNA核樣結(jié)構(gòu)和mtDNA拷貝數(shù)的功能緊密有關(guān)。
　　 (四)β淀粉肽對(duì)神經(jīng)細(xì)胞線粒體的氧化損傷及Tfam的保護(hù)作用
　　 β淀粉肽(Aβ)沉積是阿爾茨海默病發(fā)生和發(fā)展中的重要病理特征。體內(nèi)外研究均證實(shí),Aβ進(jìn)入線粒體后,直接作用于線粒體蛋白,能明顯引起線粒體功能障礙和氧化應(yīng)激。為了進(jìn)一步探討線粒體功能障礙在電磁輻射致神經(jīng)細(xì)胞損傷中的作用及Tfam的保

9、護(hù)機(jī)制,我們選擇用Aβ處理SH-SY5Y細(xì)胞造成線粒體功能障礙模型作為陽性參照。結(jié)果發(fā)現(xiàn),電磁輻射輻照致神經(jīng)細(xì)胞線粒體氧化損傷的效應(yīng)與β淀粉肽十分相似,能明顯引起神經(jīng)細(xì)胞線粒體氧化損傷。野生型Tfam和缺失型△C-Tfam的過表達(dá)均能顯著減輕β淀粉肽對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞細(xì)胞活性的損傷,降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平,提高ATP含量,有效緩解β淀粉肽引起的SH-SY5Y細(xì)胞線粒體內(nèi)8-OHdG含量的升高,維持mtDNA拷貝數(shù)和mtDNA編碼基因(N

10、D1、COX I和ND6)mRNA水平。
　　 二、鎳暴露對(duì)神經(jīng)細(xì)胞線粒體的氧化損傷及褪黑素的保護(hù)作用
　　 (一)鎳暴露對(duì)神經(jīng)細(xì)胞線粒體的氧化損傷
　　 將皮層神經(jīng)元和小鼠神經(jīng)母瘤Neuro2a細(xì)胞暴露于不同濃度的NiCl2(0.125mM,0.25mM,0.5mM和1mM)12h后或0.5mM NiCl2不同時(shí)間(0h,3h,6h,12h和24h)后,神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)ROS含量顯著升高,而且呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)關(guān)系。神

11、經(jīng)細(xì)胞線粒體功能明顯受損,表現(xiàn)為線粒體脫氫酶活性,細(xì)胞ATP含量,線粒體膜電位和mtDNA含量顯著降低。表明一定劑量的鎳暴露造成了神經(jīng)細(xì)胞線粒體的氧化損傷。
　　 (二)褪黑素預(yù)處理對(duì)鎳暴露致神經(jīng)細(xì)胞線粒體氧化損傷的保護(hù)作用
　　 用神經(jīng)系統(tǒng)抗氧化劑和線粒體功能保護(hù)劑-褪黑素(1mM)預(yù)處理皮層神經(jīng)元和Neuro2a細(xì)胞2h后,褪黑素能有效降低神經(jīng)細(xì)胞的氧化應(yīng)激,改善鎳暴露引起的線粒體功能障礙和神經(jīng)細(xì)胞活性下降。

12、　　 綜上所述,電磁輻射輻照能夠引起神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激,造成線粒體功能障礙。并且電磁輻射致線粒體氧化損傷可能與電磁輻射抑制Tfam轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)。而Tfam過表達(dá)能有效改善電磁輻射對(duì)mtDNA的氧化損傷,降低神經(jīng)元的氧化應(yīng)激,維持線粒體穩(wěn)態(tài)。Tfam這種保護(hù)效應(yīng)主要依賴于Tfam對(duì)mtDNA核樣結(jié)構(gòu)和mtDNA拷貝數(shù)的維護(hù)。與此類似,鎳暴露能明顯造成神經(jīng)細(xì)胞線粒體的氧化損傷,而褪黑素預(yù)處理能顯著拮抗鎳的神經(jīng)毒性。本研究表明,電磁輻射和鎳暴露具