幽門螺桿菌致線粒體損傷及防治.pdf

1、H.pylori與胃癌的發(fā)生關(guān)系密切，但其誘發(fā)胃癌的分子機(jī)制尚不明確。研究表明H.pylori感染引起的凋亡異常在胃癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。在H.pylori相關(guān)胃癌的防治上，單純根除幽門螺桿菌是否可逆轉(zhuǎn)胃癌前狀態(tài)尚有待更多研究證實(shí)，H.pylori疫苗可能是一種較好的防治方法，但仍未在臨床推廣應(yīng)用。流行病學(xué)調(diào)查和前瞻性研究表明，以環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase2)抑制劑作化學(xué)預(yù)防，可抑制結(jié)腸癌、食管癌和肝癌等腫瘤的發(fā)生

2、和發(fā)展，但對(duì)H.pylori相關(guān)胃癌的防治研究卻少有報(bào)道。 目的 一、建立H.pylori感染蒙古沙鼠的動(dòng)物模型。二、通過體外實(shí)驗(yàn)，觀察H.pylori對(duì)胃粘膜上皮細(xì)胞線粒體形態(tài)、功能及其所編碼的蛋白和mRNA表達(dá)變化的影響，探討線粒體損傷在H.pylori致胃癌發(fā)生中的作用。三、通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，觀察H.pylori對(duì)蒙古沙鼠胃粘膜上皮細(xì)胞線粒體形態(tài)、功能及凋亡相關(guān)蛋白的影響，探討線粒體損傷在H.pylori致胃癌發(fā)生中的

3、作用。四、通過體內(nèi)外干預(yù)實(shí)驗(yàn)，從線粒體角度探討西樂葆對(duì)H.pylori相關(guān)胃癌的預(yù)防作用及其機(jī)制。 方法 一、120只蒙古沙鼠隨機(jī)分為5組，每組24只。A組H.pylori感染組；B組H.pylori+MNNG組；C組MNNG組；D組H.pylori+MNNG+西樂葆組；E組為對(duì)照組。各組分別在實(shí)驗(yàn)后12、24、48周各處死8只，進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)：①觀察動(dòng)物體重變化；②通過尿素酶實(shí)驗(yàn)、Warthin-Starry銀染色、尿素

4、酶基因檢測(cè)H.pylori感染；③通過HE染色，光鏡觀察胃粘膜病理變化。 二、H.pylori國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)菌株NCTC11637上清多劑量多時(shí)間點(diǎn)處理體外培養(yǎng)的SGC-7901細(xì)胞后，進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)：①電鏡觀察胃粘膜上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變；②免疫組織化學(xué)法檢測(cè)Cyt-c、Bcl-2、Caspase-9含量；③流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞凋亡、線粒體膜電位變化及Ca2+含量；④RT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)mtDNACOXⅠ、COXⅡ、COXⅢmRNA的

5、表達(dá)變化；⑤Westernblot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)mtDNACOXⅠ蛋白的表達(dá)變化。 三、48只蒙古沙鼠，隨機(jī)分為2組，每組24只。A組為H.pylori感染組，B組為對(duì)照組。各組分別在實(shí)驗(yàn)后4、12、24周各處死8只，進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)：①觀察動(dòng)物體重變化；②通過尿素酶實(shí)驗(yàn)、Warthin-Starry銀染色、尿素酶基因檢測(cè)H.pylori感染；③通過HE染色，光鏡觀察胃粘膜病理變化；④電鏡觀察胃粘膜上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變；⑤免疫組織化學(xué)法

6、檢測(cè)Cyt-c、Bcl-2、Bax含量；⑥流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞凋亡、線粒體膜電位變化及胞內(nèi)游離Ca2+含量。 四、1.SPF級(jí)BALB/C-nu/nu裸小鼠10只，隨機(jī)分為2組，每組5只，A組為西樂葆治療組，B組為對(duì)照組，行裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)；2.西樂葆多劑量多時(shí)間點(diǎn)處理體外培養(yǎng)的SGC-7901細(xì)胞后，進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)：①M(fèi)TT實(shí)驗(yàn)②流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、線粒體膜電位變化及鈣含量；3.SGC-7901細(xì)胞分為四組，A組：對(duì)照

7、組，B組：加入6μl/ml的H.pylori培養(yǎng)濾液，C組：加入50μmol/L的西樂葆，D組：加入6μl/ml的H.pylori培養(yǎng)濾液和50μmol/L的西樂葆。收集細(xì)胞，用于：①RT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)環(huán)氧合酶-2mRNA的表達(dá)變化②Westernblot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)環(huán)氧合酶-2、Caspase-9蛋白的表達(dá)變化。 結(jié)論 1.蒙古沙土鼠模型是研究H.pylori感染與胃癌發(fā)生的有價(jià)值的動(dòng)物模型。H.pylori感染可

8、以直接導(dǎo)致胃癌發(fā)生。 2.在H.pylori誘發(fā)SGC-7901胃癌細(xì)胞凋亡的過程中，伴隨著凋亡早期線粒體內(nèi)Ca2+超載，膜電位的下降，Cyt-c釋放，線粒體編碼基因轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的改變，蛋白合成的減少，提示H.pylori可導(dǎo)致線粒體結(jié)構(gòu)和功能受損，并通過線粒體途徑誘發(fā)腫瘤凋亡。 3.H.pylori誘導(dǎo)蒙古沙鼠胃上皮細(xì)胞凋亡主要發(fā)生在H.pylori感染的早期；線粒體膜電位的下降和胞內(nèi)游離Ca2+的升高、膜通透性改變