MDR1基因多態(tài)性對(duì)肝癌肝移植預(yù)后的作用研究.pdf

1、肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是最常見(jiàn)的肝臟惡性腫瘤,占全世界腫瘤發(fā)生率的第五位,全球每年約有37萬(wàn)多患者被新診斷為肝細(xì)胞癌.經(jīng)過(guò)20多年的大力發(fā)展,肝移植已經(jīng)成為重要的根治性手段.然而,肝移植患者的長(zhǎng)期存活欠佳使HCC肝移植成為全球移植界最富爭(zhēng)議的焦點(diǎn)問(wèn)題之一.術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)正是影響患者長(zhǎng)期生存的關(guān)鍵影響因素.如何及早有效預(yù)測(cè)肝移植術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn),制定出合理的術(shù)前受體選擇標(biāo)準(zhǔn)已成當(dāng)務(wù)之急.

2、 在相似的發(fā)病基礎(chǔ)以及治療條件下,由于個(gè)體差異性的存在導(dǎo)致病人之間的疾病預(yù)后各不相同,而基因多態(tài)性則是個(gè)體差異性研究中的熱點(diǎn).最近一些研究表明多藥耐藥基因l(muhidrug resistarice gene l,MDRl)多態(tài)性基因型與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展具有密切的聯(lián)系.KlJrzawski等認(rèn)為其與結(jié)腸癌發(fā)生相關(guān);Stanulla等的報(bào)道則發(fā)現(xiàn),MDR1第3435位攜帶T等位基因的兒童急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)患者的中樞神經(jīng)系統(tǒng)治療

3、后的疾病復(fù)發(fā)率明顯低于其他基因型.然而,目前尚缺乏MDR1基因多態(tài)性對(duì)肝癌預(yù)后作用的相關(guān)研究,有關(guān)其與肝癌肝移植患者預(yù)后的關(guān)聯(lián)更是未見(jiàn)報(bào)道.本研究以中國(guó)人中MDRl基因最常見(jiàn)的單核苷酸多態(tài)性為切入點(diǎn)(包括C1236T,G2677A/T,C3435T),通過(guò)檢測(cè)肝癌肝移植患者M(jìn)DRl基因上述位點(diǎn)的多態(tài)性,探討MDRl基因多態(tài)性與預(yù)后的相關(guān)性,從而為指導(dǎo)臨床及早預(yù)測(cè)腫瘤復(fù)發(fā)、建立更合理的肝癌肝移植受體選擇標(biāo)準(zhǔn)提供新的參考指標(biāo). 方法

4、: 選取2003年2月至2005年1月在本中心接受肝癌肝移植患者50例(均經(jīng)病理學(xué)確診為HCC肝移植患者),均獲得隨訪并納入本研究中.50例患者在肝癌診斷明確后接受肝移植術(shù),術(shù)式均采用原位肝移植,供肝為尸肝.50例HCC肝移植患者的平均生存時(shí)間為16.1月,中位生存時(shí)間為16.3月(1-34.7月).其中39(78﹪)例病理組織學(xué)檢查證實(shí)其合并有肝硬化.術(shù)后免疫抑制劑采用以環(huán)孢霉素或他克莫司(FK506)為主的三聯(lián)方案;全組患者

5、術(shù)后未接受常規(guī)化療;移植患者術(shù)后進(jìn)入隨訪程序,常規(guī)進(jìn)行甲胎蛋白(AFP)監(jiān)測(cè)、B超、胸片及全身骨骼ECT等檢查. 取患者外周抗凝血分離單個(gè)核細(xì)胞,應(yīng)用OIAamp DNA Kit(QIAGEN,德國(guó))提取基因組DNA.采用PCR-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)法進(jìn)行基因多態(tài)性分析.PCR反應(yīng)體系共50μl,其中包括50 ng/μl基因組DNA 4μl,10×PCR緩沖液5μl,氯化鎂(1 mmol/L)4μl,dNTP

6、(200 μmmol/A)2μl,上下游引物(0.2μmmol/L)各2μl以及Taq酶(1 U/μ1)0/6 μl,余用雙蒸水補(bǔ)足.PCR反應(yīng)的引物序列、PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度詳見(jiàn)表1.PCR反應(yīng)過(guò)程如下:94℃預(yù)變性4 min后,94℃變性45 s、 54℃ (C1236T G2677A/T)或56℃ (C3435T)退火45 s、72℃延伸45 s,共循環(huán)34次,最后再72℃延伸10 min.取PCR產(chǎn)物6μl,加入1 U限制性?xún)?nèi)切酶,在

7、20μl反應(yīng)體系中37℃水浴過(guò)夜進(jìn)行酶切反應(yīng).最后經(jīng)15﹪聚丙烯酰胺凝膠電泳后銀染判定結(jié)果.所有統(tǒng)計(jì)分析均采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行.x2(卡方)檢驗(yàn)用于比較各基因型與腫瘤術(shù)后復(fù)發(fā)之間有無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異.與無(wú)瘤以及總體生存率統(tǒng)計(jì)采用Kaplan-ACeie方法,組間差異采用Log-rank檢驗(yàn)法比較.采用Forward方式的Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型進(jìn)行多因素分析.P<0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異. 結(jié)果: 根據(jù)酶切產(chǎn)物進(jìn)行M

8、DRl基因分型,將50例研究對(duì)象分為術(shù)后肝癌復(fù)發(fā)和不復(fù)發(fā)兩組,兩組間MDRl G1236T、C3435T、G2677T的多態(tài)性分布無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異.根據(jù)MDRl基因型將研究對(duì)象分成2677A攜帶型(AA+AT+GA)和2677A非攜帶型(TT+GT+GG)兩組.2677A攜帶與否在兩組間的分布差異則呈現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05). 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析2677A攜帶情況與患者臨床資料的關(guān)系后顯示:2677A攜帶型與非攜帶型兩組之間在年齡、性別

9、、門(mén)靜脈癌栓、腫瘤大小、腫瘤數(shù)量、肝硬化背景、術(shù)前AFP水平和組織學(xué)分級(jí)上無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異. 隨訪結(jié)果顯示:50例患者中20例死于復(fù)發(fā),8例復(fù)發(fā)后存活,22例存活且無(wú)復(fù)發(fā).其中12例2677A攜帶型患者中,存活且無(wú)復(fù)發(fā)者為9例;而38例2677A非攜帶型患者中,存活且無(wú)復(fù)發(fā)者僅為13例.2677A攜帶型和非攜帶型患者的1年生存率為91.7﹪和65.6﹪,1年無(wú)瘤生存率分別為83.3﹪和36.5﹪,前者的無(wú)瘤生存率顯著高于后者(P<0

10、.05),但總體生存率無(wú)顯著性差異(P>0.05).此外,單因素分析顯示,影響HCC肝移植患者術(shù)后無(wú)瘤生存率的變量有6項(xiàng),即PVTT、腫瘤大小、腫瘤數(shù)量、術(shù)前AFP水平、組織學(xué)分級(jí)和12677A攜帶型.而影響總體生存率的變量有5項(xiàng),即PVTT、腫瘤大小、腫瘤數(shù)量、術(shù)前AFP水平和組織學(xué)分級(jí).上述因素行Cox逐步回歸分析結(jié)果顯示:術(shù)前AFP水平、腫瘤數(shù)量、PVTT和12677A攜帶型與無(wú)瘤生存率存在顯著相關(guān). 結(jié)論: 1