低氧預處理誘導的HIF-1α可促進缺血再灌注損傷肝臟糖代謝并保護線粒體的研究.pdf

1、在肝移植手術過程中，從供肝的切取、修整、直到移植肝臟血液再通，肝臟勢必會經歷一系列的缺血再灌注損傷。學者們先前的研究提示，低氧預處理可給予大腦組織保護。隨后的研究也顯示這一內源性保護機制同樣出現在肝臟和腎臟組織中。在腫瘤細胞中，低氧誘導因子-1α在低氧條件下起了非常重要的作用，低氧誘導因子-1α是重要的轉錄因子來介導細胞低氧反應。為了減少在需氧代謝中活性氧對細胞DNA的損傷，由低氧誘導因子-1α調整介導的糖酵解轉錄可使腫瘤細胞適應低氧環(huán)

2、境。
　　學者們先前的研究發(fā)現低氧誘導因子-1α可以減輕大鼠肝移植模型中的缺血再灌注損傷的發(fā)生。研究顯示低氧預處理可充分激活B淋巴細胞-2(Bcl-2)信號通路，從而上調Bcl-2蛋白，Bcl-2蛋白作為一種可以抑制凋亡的調節(jié)因子，通過調整線粒體的結構來調節(jié)凋亡的發(fā)生。其他的研究發(fā)現:低氧誘導因子-1α作為一個主要的轉錄因子，調節(jié)糖酵解和腫瘤細胞的糖代謝。低氧誘導因子-1α對糖代謝相關酶以及腫瘤細胞在有氧和低氧環(huán)境下的乳酸化合成也

3、有影響。己糖激酶(HK)通過產生果糖-6-磷酸來影響葡萄糖的變化，其可在糖酵解過程中，通過磷酸戊糖途徑進入糖酵解來產生能量(PPP)，期間產生的NADPH和合成的中間體轉換為糖原進行儲存，而HK-2在促進合成代謝途徑方面起關鍵得作用，且在癌癥中高表達。
　　本實驗，我們通過低氧預處理來促進大鼠肝臟組織低氧誘導因子-1α的表達，并且檢測糖代謝的變化，同時檢測NF-κB和細胞外調節(jié)蛋白激酶(ErK)通路.意在表明低氧誘導因子-1α通過

4、促進己糖激酶2(HK-2)和葡萄糖轉運蛋白1(Glut-1)表達從而減輕肝臟炎癥及原位肝移植后的缺血再灌注損傷。
　　第一部分 低氧預適應處理對肝移植大鼠肝細胞HIF-1α表達的影響
　　目的：
　　本實驗對大鼠行低氧預適應(Hypoxia preconditioning HP)處理，隨后進行自體原位肝移植，探討低氧預適應肝移植大鼠術后低氧誘導因子-1α(Hypoxia-inducible Factor-1α，HIF-

5、1α)表達情況。
　　方法：
　　1.清潔近交系Sprague Dawley純系雌性大鼠被隨機分為3組:低氧預處理自體原位肝移植組（HP組n=36）:供體術前行低氧預處理（氮氧混合氣體，流量5 L/min，含8％氧氣，共處理90分鐘），8小時后行大鼠自體肝移植;大鼠自體肝移植組（AT組n=36）:大鼠行自體原位肝移植;正常大鼠對照組(Ctrl組n=16)。
　　2.各組大鼠切取肝中葉，用RT-PCR技術檢測肝臟組織HI

6、F-1α mRNA表達的變化結果，Western blot檢測HIF-1α蛋白表達變化結果。
　　結果：
　　1.HIF-1α mRNA表達結果:
　　為了檢驗低氧欲處理是否可以增加大鼠肝臟組織低氧誘導因子-1α的表達，大鼠在低氧環(huán)境中接受90分鐘低氧預處理。治療后12小時，肝組織中低氧誘導因子-1α顯著增加(HP vs.Ctrl，P＜0.001)。相比于對照組，在術后12小時，肝組織中低氧誘導因子-1α的表達仍持續(xù)增

7、高(HP vs.AT, P＜0.001)。同時，在AT組，我們觀測到低氧誘導因子-1α也會增高，只是其增高水平不及HP組(ATvs.Ctrl，P=0.0597)。
　　2.HIF-1α蛋白表達結果:
　　在蛋白水平，術后24小時HP組HIF-1α在肝組織的表達較AT組和Ctrl組高。
　　結論：
　　經過低氧預適應處理大鼠自體肝移植術后，大鼠肝臟組織HIF-1α mRNA和HIF-1α蛋白表達均增多。
　　

8、第二部分 低氧誘導因子-1α促進缺血再灌注肝臟糖代謝保護線粒體的研究
　　目的：
　　該實驗隊大鼠自體原位肝移植模型上進行，檢測到低氧預處理大鼠HIF-1αmRNA和HIF-1α蛋白表達增多這一結論基礎上。從而繼續(xù)探討低氧預處理是否對缺血再灌注肝臟糖代謝有影響及肝細胞線粒體是否有保護作用。
　　方法：
　　1.清潔近交系Sprague Dawley純系雌性大鼠被隨機分為3組:低氧預處理自體原位肝移植組（HP組n=

9、36）:供體術前行低氧預處理（氮氧混合氣體，流量5 L/min，含8％氧氣，共處理90分鐘），8小時后行大鼠自體肝移植;大鼠自體肝移植組（AT組n=36）:大鼠行自體原位肝移植;正常大鼠對照組(Ctrl組n=16)。
　　2.自體肝移植大鼠術后不同時間段指標及形態(tài)學變化的比較。術后三組大鼠分別切取肝右葉，通過顯微鏡、電鏡觀察三組肝細胞組織學改變及肝細胞線粒體損傷情況;抽取尾靜脈血檢測肝功能指標變化，檢測血清中的腫瘤壞死因子-α(T

10、NF-α)和白介素-6（IL-6）;RT-PCR技術檢測肝臟組織葡萄糖轉運蛋白-1(Glut-1)mRNA、己糖激酶-2（Hexokinase-2 HK-2）mRNA、乳酸脫氫酶(Lactatedehydrogenase LDH)及丙酮酸脫氫酶激酶（PDK-1）表達的變化情況。
　　結果：
　　1.低氧預處理促使NF-κB和ErK的表達
　　自體原位肝移植術后，我們觀察到術后24小時，HP組在大鼠肝組織中，NF-κB(

11、HP vs.AT,P=0.0078)磷酸化和ErK(HP vs.AT,P=0.0044)磷酸化均較AT組顯著增加。
　　2.低氧預處理后，隨著低氧誘導因子的表達，肝細胞中糖代謝隨之增加
　　在我們的實驗中，我們觀察到術后肝組織中Glut-1 mRNA水平增高(HP vs.AT,12hand24h，P＜0.001)。HK-2 mRNA水平也增高(HP vs.AT,24 h，P=0.004)。術后24小時乳酸脫氫酶(LDH) m

12、RNA水平顯著增高(HP vs.AT,24 h，P=0.003;48 h，P=0.031)。 HP組術后丙酮酸脫氫酶激酶(PDK-1)術后顯著增高(HP vs.AT,24 h，P=0.007;48 h，P=0.001)。術后24小時HP組肝組織裂解液Glut-1表達明顯高于AT組(HP vs.AT,P=0.0476)，HK-2的表達也明顯增高(HP vs.AT,P=0.0373)。
　　3.低氧預處理保護肝臟、減輕肝臟缺血再灌注損

13、傷
　　我們通過透射電鏡觀察肝細胞線粒體形態(tài)學變化(46000X)。HP組較AT線粒體形態(tài)上更少腫脹。電鏡下，我們可以看到嵴斷裂，但仍有少部分排列尚好。內質網結構尚存。而AT組，線粒體顯現出不同大小，有些甚至明顯松解，發(fā)生空泡變性，可見嵴的減少，因被不同程度的破壞或者消失。我們觀察線粒體復合體，發(fā)現在AT組復合體1由于被破壞而低表達;HP組和對照組相比，復合體1沒有明顯變化。通過TUNEL分析我們發(fā)現AT組在術后12小時肝臟組織發(fā)

14、現更多的凋亡。在肝細胞裂解液中，術后12小時Caspase-3AT組明顯高于HP組(HPvs.AT,P=0.0119)，同樣PARP在AT組也明顯增高(HP vs.AT,P=0.0134)。
　　4.大鼠模型中肝臟功能及炎癥的變化
　　為了證實缺氧欲處理是否可保護肝臟免受缺血再灌注損傷，我們檢測了大鼠血清中ALT和AST。HP組血清中ALT和AST輕度升高，AT組，ALT和AST升高明顯，兩組比較，具有顯著性差異(ALT:

15、HP vs.AT,6 h，P=0.003;12 h，P=0.001;AST: HP vs.AT,12 h，P=0.002;24 h，P=0.006)。我們檢測血清中的腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白介素-6(IL-6)，發(fā)現HP組由于更低的腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白介素-6(IL-6)表達而表現出更輕的炎癥反應(TNF-α:HP vs.AT,48 h，P=0.0008; IL-6: HP vs.AT,48 h，P=0.0213