內(nèi)源性血管生成抑制因子Arresten基因的克隆、表達(dá)、純化及活性的測(cè)定.pdf

1、目的：構(gòu)建內(nèi)源性血管生成抑制因子Arresten基因的原核表達(dá)載體，優(yōu)化表達(dá)條件，初步探討表達(dá)蛋白的抑制血管活性。 方法：從GenBank庫(kù)中查找Arresten基因并獲取其基因序列及蛋白序列，用DNAman軟件設(shè)計(jì)引物。從健康產(chǎn)婦胎盤組織中提取人總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄—聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)擴(kuò)增出Arresten基因，低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收純化，純化產(chǎn)物和質(zhì)粒pBV220連接，并轉(zhuǎn)化E.coliJM109、DH5α

2、、BL21、BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，在氨芐陽(yáng)性平板中篩選陽(yáng)性菌落。重組質(zhì)粒用PCR法和三種限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、EcoRⅠ和PvuⅡ(基因序列155位的酶切位點(diǎn))酶切進(jìn)行鑒定，并進(jìn)行序列測(cè)定，命名為pBV220-Arr。構(gòu)建的重組質(zhì)粒pBV220-Arr轉(zhuǎn)化到宿主菌——E.coliJM109、DH5α、BL21、BL21(DE3)中進(jìn)行原核表達(dá)。經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳圖條帶分析，并結(jié)合濕菌重篩選出最優(yōu)表達(dá)菌種，進(jìn)行培養(yǎng)溫度、

3、培養(yǎng)時(shí)間、表達(dá)溫度、表達(dá)時(shí)間及溶解氧量五方面表達(dá)，確定最優(yōu)表達(dá)體系；超聲破菌，分離得到包涵體，并對(duì)其進(jìn)行洗滌純化復(fù)性，考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白含量；雞胚絨毛尿囊膜實(shí)驗(yàn)觀察新生血管生長(zhǎng)抑制情況。 結(jié)果：成功篩選出Arresten基因，通過(guò)測(cè)序結(jié)果表明在第132、148、200、236位基因序列不同；通過(guò)成功構(gòu)建的重組質(zhì)粒pBV220-Arr，在E.coliJM109、DH5α、BL21、BL21(DE3)中均表達(dá)出Arresten蛋白

4、，SDS-PAGE顯示表達(dá)產(chǎn)物分子量約為26KD，表達(dá)產(chǎn)物主要以包涵體形式存在；通過(guò)優(yōu)化表達(dá)，結(jié)果在E.coliBL21(DE3)中30℃培養(yǎng)4h，42℃誘導(dǎo)表達(dá)4h，溶解氧量比例在1∶5時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高，表達(dá)量約占全菌蛋白的25％以上；進(jìn)一步純化表達(dá)，用2mol/L尿素、2％的TritonX-100溶液和1M的蔗糖溶液，及少許的EDTA洗滌效果最好，表達(dá)量約占全菌蛋白的40％以上，用梯度稀釋法復(fù)性得到Arresten蛋白；經(jīng)活性分析證

5、實(shí)初步復(fù)性的Arresten蛋白與陰性對(duì)照組比較統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性差異，證明其有抑制新生血管生成的作用。 結(jié)論：應(yīng)用基因工程技術(shù)，成功篩選出Arresten基因，并構(gòu)建了原核表達(dá)重組體pBV220-Arr；通過(guò)優(yōu)化表達(dá)，得到最優(yōu)表達(dá)菌種E.coliBL21(DE3)及最優(yōu)表達(dá)條件，能高效表達(dá)重組Arresten蛋白；經(jīng)過(guò)用尿素與TritonX-100及蔗糖溶液綜合方法洗滌純化，純化效果最好并獲得了較純的Arresten蛋白；經(jīng)過(guò)C