左旋精氨酸對(duì)深低溫停循環(huán)腦保護(hù)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、深低溫停循環(huán)(Deephypothermiccirculatoryarrest，DHCA)技術(shù)可以提供一個(gè)無(wú)血而寧?kù)o的手術(shù)環(huán)境，是部分嬰幼兒先天性心臟病及成人復(fù)雜大血管疾病外科治療中的重要手段。近年來(lái)，隨著心、腦、肺、肝、腎等保護(hù)技術(shù)的改進(jìn)、多學(xué)科合作增加，DHCA的應(yīng)用日益廣泛，如嬰幼兒先天性心臟病、夾層動(dòng)脈瘤、弓部動(dòng)脈瘤、顱內(nèi)巨大動(dòng)脈瘤、布卡氏綜合癥、大血管創(chuàng)傷、以及侵及心臟、大血管的腫瘤切除等手術(shù)領(lǐng)域。腦是全身代謝率最高的器官之一

2、。腦的重量約占體重的2％，在安靜狀態(tài)下的腦血流量卻占心排出量的15％，耗氧量約占全身的20％，因此腦對(duì)缺血缺氧最敏感，同時(shí)它對(duì)缺血缺氧的耐受性也最差。深低溫下腦代謝亦然存在，長(zhǎng)時(shí)間DHCA加上原有腦血管病變、術(shù)中微栓栓塞等常導(dǎo)致不同程度的神經(jīng)系統(tǒng)損害。DHCA相關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥嚴(yán)重威脅術(shù)后患者生命及康復(fù)。DHCA腦損害的機(jī)制復(fù)雜，目前的腦保護(hù)措施尚不能有效降低DHCA腦損害的發(fā)生。一氧化氮(nitricoxide，NO)是一種化學(xué)性質(zhì)

3、活潑的氣體小分子，具有非常廣泛生物學(xué)活性的物質(zhì)，自從1987年NO被確認(rèn)為內(nèi)皮源性舒血管因子(endotheliumderivedrelaxingfactor，EDRF)以來(lái)，對(duì)其在生理狀態(tài)及各種病理狀態(tài)下的生物學(xué)功能及分子生物學(xué)特性倍受關(guān)注。NO兼有信使分子和神經(jīng)毒性?xún)煞矫嫔飳W(xué)活性，與缺血缺氧及再灌注性腦損害發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系。NO是由左旋精氨酸(L-arginin()L-arg)在一氧化氮合酶(NOS)的催化下生成，一氧化氮合酶有

4、神經(jīng)元型(nNOS)、內(nèi)皮型(eNOS)和誘生型(iNOS)三種亞型。近年來(lái)研究表明，不同亞型的NOS介導(dǎo)不同的生物學(xué)效應(yīng)。腦缺血早期源于eNOS的NO能自由通過(guò)血管內(nèi)皮進(jìn)入血管平滑肌細(xì)胞，激活胞漿中的鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶(Gc)使細(xì)胞內(nèi)的環(huán)鳥(niǎo)苷酸(cGMP)水平升高，進(jìn)而通過(guò)cGMP依賴(lài)的離子通道機(jī)制使血管平滑肌舒張，增加腦血流量。同時(shí)可降低血小板和白細(xì)胞對(duì)內(nèi)皮的粘附，并通過(guò)此作用保護(hù)腦血管內(nèi)膜不受損，有助于微循環(huán)的通暢。內(nèi)皮源性NO可阻斷N

5、-甲基-D-天(門(mén))冬氨酸(NMDA)受體的過(guò)度興奮，減少Ca2＋內(nèi)流，從而減輕神經(jīng)元的興奮性毒性損害。而缺血后期及再灌注期，神經(jīng)細(xì)胞中nNOS和iNOS產(chǎn)生的NO，可激活NMDA受體，介導(dǎo)自由基損傷及興奮性氨基酸(EAA)的神經(jīng)毒性作用。以往研究多選用一氧化氮合酶非選擇性抑制劑如NG-硝基-L-精氨酸(L-NA)和L-NAME等，屬競(jìng)爭(zhēng)性非亞性特異性抑制劑，受給藥時(shí)間、給藥順序、給藥劑量等因素的影響結(jié)果差異較大。本實(shí)驗(yàn)利用NO合成底物

6、—左旋精氨酸(L-arg)與神經(jīng)元型NOS特異性抑制劑—7-硝基吲唑(7-nitroindazole，7-Ni)預(yù)處理，干預(yù)不同亞型NOS活性，觀察其對(duì)DHCA中腦代謝、自由基、超微結(jié)構(gòu)等的影響及可能的機(jī)制。 目的： 觀察L-arg預(yù)處理與L-arg、7-Ni聯(lián)合處理對(duì)犬DHCA不同時(shí)期腦代謝、自由基、NSE及超微結(jié)構(gòu)的影響。檢測(cè)DHCA早期不同時(shí)間頸靜脈血氧飽和度(SjvO2)、頸靜脈-動(dòng)脈乳酸含量差(Djv-aL)、

7、腦組織Na+-K+ATP酶、SOD、MDA、腦脊液NSE及皮質(zhì)、海馬超微結(jié)構(gòu)改變，以及血漿NO、腦組織NOS活性變化規(guī)律。推斷L-arg和7-Ni在DHCA早期腦保護(hù)中的作用及機(jī)制，以探索預(yù)防和治療DHCA腦損害的方法。 方法： 1、采用成年犬DHCA模型，選擇健康成年雜種犬15只，隨機(jī)分為3組。對(duì)照組(Ⅰ組)；L-arg處理組(Ⅱ組)：停循環(huán)前60min給予L-arg100mg/kg靜脈注射預(yù)處理；L-arg、7-Ni

8、聯(lián)合處理(Ⅲ組)：停循環(huán)前60min給予L-arg100mg/kg靜脈注射、7-Ni25mg/kg動(dòng)脈注射聯(lián)合處理。實(shí)驗(yàn)犬以3％戊巴比妥鈉誘導(dǎo)麻醉，氣管插管，呼吸機(jī)輔助呼吸。左頸靜脈逆行插管取腦靜脈血，左頸動(dòng)脈插管測(cè)MBP。右側(cè)開(kāi)顱取腦皮質(zhì)，腦室插管引流取腦脊液。主動(dòng)脈插管及上、下腔插管建立體外循環(huán)轉(zhuǎn)流降溫至鼻咽部溫18℃停循環(huán)。90min后恢復(fù)循環(huán)、復(fù)溫再灌注至鼻咽部溫37℃后停機(jī)，停機(jī)60min后放血處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。2、各組分別于停循

9、環(huán)前30min、停循環(huán)時(shí)(0min)、停循環(huán)45min、停循環(huán)90min、復(fù)溫再灌注60min抽取頸靜脈、頸動(dòng)脈血測(cè)SjvO2、Djv-aL、NO。分別于上述各時(shí)間點(diǎn)取腦皮質(zhì)，制備胸勻漿測(cè)Na+-K+ATPase、SOD、NOS活性及MDA含量。停循環(huán)前30min、再灌注60min留取腦脊液，放射免疫法測(cè)腦脊液NSE含量。實(shí)驗(yàn)犬處死后取腦組織測(cè)含水量。同時(shí)頸動(dòng)脈灌注4％多聚甲醛固定，取腦皮質(zhì)、海馬行透射電鏡觀察腦組織超微結(jié)構(gòu)。

10、3、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差(X±S)方式記錄，SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，重復(fù)測(cè)量的方差分析及單因素方差分析數(shù)據(jù)對(duì)比，LSD法兩兩比較，以P≤0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果： 1、DHCA開(kāi)始后SjvO2、Na+-K+ATPase下降，Djv-aL升高，復(fù)溫后緩慢恢復(fù)。兩處理組SjvO2、Na+-K+ATPase高于對(duì)照組(P值分別為0.001和0.023)，而Djv-aL低于對(duì)照組(P=0.010)。L-arg、

11、7-Ni聯(lián)合處理組與L-arg預(yù)處理組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。 2、DHCA后隨時(shí)間的推移SOD活力明顯下降，MDA含量明顯上升，復(fù)溫再灌注后SOD達(dá)到最低值，MDA達(dá)到最高值。不同時(shí)間點(diǎn)之間差異顯著(P值均小于0.001)；各組之間存在顯著性差異(P=0.008和0.017)，其中DHCA90min和復(fù)溫再灌注后差異最大，L-arg、7-Ni聯(lián)合處理組SOD最高，MDA最低，對(duì)照組SOD最低而MDA最高，L-ar

12、g處理組介于二者之間，兩兩對(duì)比復(fù)溫灌注后L-arg、7-Ni聯(lián)合處理組與L-arg處理組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.004)。 3、L-arg處理組與L-arg、7-Ni聯(lián)合處理組腦組織含水量顯著低于對(duì)照組(P=0.044)，其中以L(fǎng)-arg、7Ni聯(lián)合處理組最低，兩處理組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。 4、兩處理組腦脊液NSE含量顯著低于對(duì)照組(P=0.038)，其中L-arg、7-Ni聯(lián)合處理組腦脊液NSE

13、含量最低，兩處理組之間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.469)。 5、L-arg預(yù)處理和L-arg、7-Ni聯(lián)合處理后約半小時(shí)血漿NO、腦組織NOS顯著升高，降溫及停循環(huán)后稍有下降，復(fù)溫后再度升高。不同時(shí)間點(diǎn)間和各組之間差異顯著(P值分別為0.000、0.000和0.013、0.008)。復(fù)溫再灌注后L-arg、7-Ni聯(lián)合處理組NOS低于L-arg處理組，有顯著性差異(P=0.003)。 6、腦組織超微結(jié)構(gòu)變化：

14、 對(duì)照組DHCA及復(fù)溫再灌注后腦皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變比較明顯，主要表現(xiàn)為線(xiàn)粒體腫脹明顯，部分呈氣球樣變，線(xiàn)粒體嵴減少、脫落；細(xì)胞膜連續(xù)性完整，雙層結(jié)構(gòu)顯示不清；溶酶體增生明顯，并可見(jiàn)吞噬的線(xiàn)粒體。L-arg處理組與L-arg7-Ni聯(lián)合處理組神經(jīng)元細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變較輕，表現(xiàn)在線(xiàn)粒體腫脹較輕，空泡樣變化少見(jiàn)，線(xiàn)粒體嵴部分脫落，數(shù)量基本正常，雙層膜結(jié)構(gòu)完整，無(wú)中斷，溶酶體增生明顯，并可見(jiàn)髓鞘板層樣剝離。兩處理組腦超微結(jié)構(gòu)無(wú)明顯差異。

15、 結(jié)論： 1、L-arg預(yù)處理可提高DHCA期SjvO2，改善DHCA期腦氧代謝平衡。7-Ni對(duì)此作用無(wú)影響。 2、L-arg預(yù)處理可降低DHCA期腦乳酸生成及ATP酶消耗，改善腦能量代謝。7-Ni對(duì)此作用無(wú)影響。 3、L-arg預(yù)處理可增加DHCA期腦SOD活性，減少M(fèi)DA生成，減輕了腦細(xì)胞的自由基損傷。7-Ni與L-arg有協(xié)同作用，可進(jìn)一步增加再灌注早期腦SOD活性，減少M(fèi)DA生成，進(jìn)一步減輕再灌注