冰片和薄荷醇通過P糖蛋白對藥物經(jīng)皮吸收的研究.pdf

1、目的:從整體和細(xì)胞水平探討冰片和薄荷醇對皮膚內(nèi)P糖蛋白（P-gp）的影響。研究P-gp轉(zhuǎn)運(yùn)功能與藥物經(jīng)皮吸收效果的關(guān)系，探討P-gp在經(jīng)皮給藥研究中的潛在價(jià)值；并進(jìn)一步深入研究冰片、薄荷醇的促透機(jī)制，為促透劑的應(yīng)用與開發(fā)提供依據(jù)。
　　方法：1.免疫組化實(shí)驗(yàn)
　　選用小鼠背部皮膚，采用免疫組化SABC法，鏡下觀察染色的分布。
　　2.體外皮膚滲透性實(shí)驗(yàn)
　　采用雙室透皮裝置，選用小鼠背部皮膚，通過測定羅丹明123

2、（Rh123）與熒光素鈉的累積滲透量，比較透皮吸收的效果。
　　3.MTT藥物濃度篩選實(shí)驗(yàn)
　　采用MTT法對細(xì)胞模型進(jìn)行毒性實(shí)驗(yàn)，使用酶標(biāo)儀測定OD值，計(jì)算細(xì)胞存活率。
　　4.細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)
　　體外培養(yǎng)人微血管內(nèi)皮細(xì)胞（HDMEC），采用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)檢測HDMEC中P-gp的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)分組為空白組、DMSO組、冰片組、薄荷醇組。
　　5.逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)實(shí)驗(yàn)
　　體外培養(yǎng)HDM

3、EC，實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分為空白組，62.5μM、125μM、250μM、500μM冰片組、62.5μM、125μM、250μM、500μM薄荷醇組。采用RT-PCR技術(shù)檢測MDR1mRNA的表達(dá)。
　　6.蛋白質(zhì)印跡法(Western-blot)實(shí)驗(yàn)
　　體外培養(yǎng)HDMEC，實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分為空白組，62.5μM、125μM、250μM、500μM冰片組，62.5μM、125μM、250μM、500μM薄荷醇組。采用Western-blo

4、t技術(shù)檢測P-gp的表達(dá)。
　　7.細(xì)胞底物積累外排實(shí)驗(yàn)
　　體外培養(yǎng)HDMEC，實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分為空白組，維拉帕米陽性對照組、62.5μM、125μM、250μM、500μM冰片組，62.5μM、125μM、250μM、500μM薄荷醇組。采用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)，半定量細(xì)胞積累及外排后的熒光強(qiáng)度。
　　8.離體皮膚滲透性實(shí)驗(yàn)
　　采用雙室透皮裝置，選用小鼠背部皮膚，測定添加了高、中、低濃度冰片、薄荷醇的Rh123與熒光

5、素鈉的累積滲透量，維拉帕米作為陽性對照藥物。
　　9.在體皮膚滲透性實(shí)驗(yàn)
　　選用小鼠在體透皮給藥，設(shè)置空白組、冰片組以及薄荷醇組。取組織勻漿液樣本，采用高效液相（HPLC）測定Rh123滲透量。
　　結(jié)果：1.P-gp在皮膚中的分布與表達(dá)
　　小鼠皮膚表皮、真皮以及皮下組織中均有明顯DAB棕色染色。
　　2.P-gp在皮膚中的功能作用
　　體外離體透皮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Rh123累積滲透量明顯多于熒光素

6、鈉（p<0.01）,維拉帕米+Rh123組透過量較Rh123組累積滲透量顯著增多（p<0.01），維拉帕米+熒光素鈉組與熒光素鈉組的累積滲透量無顯著性差異（p>0.05）。
　　3.冰片、薄荷醇給藥濃度的確定
　　MTT細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)顯示，冰片給藥濃度不高于500μM時，HDMEC細(xì)胞活性>80％，薄荷醇給藥濃度不高于600μM時，HDMEC細(xì)胞活性>80%，陽性對照藥物維拉帕米給藥濃度不高于30μM時，HDMEC細(xì)胞活性>8

7、0%。
　　4.P-gp在HDMEC中的表達(dá)及冰片、薄荷醇對其表達(dá)的影響
　　細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示，HDMEC有明顯綠色熒光。與空白組相比，冰片組HDMEC的熒光強(qiáng)度較弱，薄荷醇組較強(qiáng)。
　　5.冰片、薄荷醇對MDR1mRNA表達(dá)的影響
　　冰片、薄荷醇給藥孵育48h后，冰片組HDMEC中MDR1mRNA的表達(dá)量與空白組相比顯著減少（p<0.01）；薄荷醇組MDR1mRNA的表達(dá)量隨薄荷醇濃度的升高而增高，與空白

8、組相比顯著增加（p<0.01）。
　　6.冰片、薄荷醇對P-gp表達(dá)的影響
　　冰片、薄荷醇給藥孵育48h后，與空白組相比，冰片50μM組 HDMEC中P-gp的表達(dá)量無明顯變化（P>0.05），其余冰片組顯著減少（p<0.01）；與空白組相比，薄荷醇組P-gp的表達(dá)量顯著增加（p<0.01）。
　　7.冰片、薄荷醇對P-gp功能的影響
　　細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HDMEC中Rh123的積累量隨冰片給藥濃度的

9、升高而增大（p<0.01），隨薄荷醇給藥濃度的升高而減少（p<0.01）。冰片組HDMEC中Rh123的外排量顯著增加（p<0.01），Rh123的外排量隨薄荷醇濃度的升高無明顯變化，但均高于空白組（p<0.01）。
　　8.冰片、薄荷醇通過P-gp對藥物經(jīng)皮吸收的影響
　　體外離體透皮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，薄荷醇組 Rh123累積滲透量明顯多于熒光素鈉（p<0.01）,冰片組Rh123累積滲透量明顯少于熒光素鈉（p<0.01）,薄

10、荷醇組Rh123累積滲透量明顯多于冰片組（p<0.01）。
　　9.在體皮膚滲透性實(shí)驗(yàn)
　　高效液相儀檢測組織勻漿上清液樣本，樣品濃度均在檢測限以下，無檢測結(jié)果。
　　結(jié)論：1.P-gp在皮膚中有明顯分布與表達(dá)。
　　2.皮膚中P-gp可促進(jìn)其底物的經(jīng)皮吸收，對非底物的經(jīng)皮吸收影響不顯著。
　　3.冰片可抑制HDMEC中MDR1mRNA及P-gp的表達(dá)，薄荷醇對HDMEC中MDR1 mRNA及P-gp的表達(dá)