B細(xì)胞活化因子與系統(tǒng)性紅斑狼瘡關(guān)聯(lián)性的研究.pdf

1、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemiclupuserythematosus，SLE)是一類(lèi)常見(jiàn)病、多發(fā)病，主要表現(xiàn)為B細(xì)胞過(guò)度增殖活化、產(chǎn)生多種自身抗體(以抗雙鏈DNA抗體最為重要)。該病多發(fā)于20～50歲的中青年女性，男女比例約1：8；如果診斷治療不及時(shí)，60％～70％的患者將出現(xiàn)腎功能衰竭，嚴(yán)重影響了勞動(dòng)力質(zhì)量。 B細(xì)胞活化因子(B-cellactivatingfactor，BAFF)，又被稱(chēng)為B細(xì)胞刺激因子(B-Lymphocy

2、testimulator,BLyS)、TNF相關(guān)的淋巴細(xì)胞表達(dá)配體1(TNFandApoL-relatedleukocyte-expressedligand1，TALL-1)、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和活化NF-κB的TNF類(lèi)似物(TNFhomologuethatactivatesapoptosis，NF-κB，andJNK，THANK)等，是1999年發(fā)現(xiàn)的一種多功能的共刺激分子。 BAFF的受體都是TNF受體家族新成員，主要有三種：穿膜

3、蛋白活化物(transmembraneactivatorandCAML-interactor,TACI)，主要表達(dá)于B細(xì)胞和活化的T細(xì)胞；B細(xì)胞成熟抗原(Bcellmaturationantigen，BCMA)，主要表達(dá)于B細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞；BAFF受體(BAFFreceptor，BAFF-R，又稱(chēng)BR3)，僅表達(dá)于B細(xì)胞，且與BAFF的結(jié)合最特異。BAFF通過(guò)這三種特異性細(xì)胞膜受體，在促進(jìn)B淋巴細(xì)胞分化發(fā)育、激活和免疫球蛋白產(chǎn)生，調(diào)節(jié)免

4、疫反應(yīng)、自身免疫性疾病尤其是SLE的過(guò)程中起著重要作用。由于BAFF對(duì)B細(xì)胞活化、及自身免疫病的重要調(diào)控作用，從被發(fā)現(xiàn)至今，BAFF就一直是國(guó)際免疫學(xué)界的研究熱點(diǎn)之一。 目前有關(guān)BAFF基因上游調(diào)控元件的準(zhǔn)確定位及其與相應(yīng)的DNA結(jié)合蛋白的相互作用的研究尚屬空白，更未見(jiàn)任何有關(guān)病理?xiàng)l件下BAFF基因調(diào)控元件的功能變化的報(bào)道。鑒于此，該文認(rèn)為有必要聯(lián)合蛋白質(zhì)和核酸(mRNA)水平研究BAFF在SLE中的異常表達(dá)，探討B(tài)AFF所介導(dǎo)

5、的B細(xì)胞激活對(duì)SLE的致病機(jī)理，并進(jìn)一步在分子水平開(kāi)展BAFF基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制的研究，形成完整的從轉(zhuǎn)錄水平到核酸再到蛋白質(zhì)水平的調(diào)控理論，為揭開(kāi)BAFF的致病作用、拓展阻斷BAFF活化的新技術(shù)/方法提供依據(jù)，為SLE乃至其他自身免疫病的藥物治療/篩選提供重要的調(diào)控靶序列。 該文進(jìn)行了以下三方面的實(shí)驗(yàn)研究： 一、建立人B細(xì)胞活化因子基因表達(dá)含量熒光定量檢測(cè)方法的研究 不斷有證據(jù)顯示BAFF在SLE的發(fā)生和發(fā)展中具有

6、重要的作用，熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)是近年來(lái)涌現(xiàn)的定量mRNA的新技術(shù)，然而國(guó)內(nèi)有關(guān)BAFF基因的熒光定量PCR測(cè)定方法還未見(jiàn)報(bào)道。這部分研究基于TaqMan熒光探針技術(shù)，建立了實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄(RT)-PCR方法來(lái)檢測(cè)BAFFmRNA的表達(dá)含量。利用PCGENE軟件設(shè)計(jì)BAFF基因?qū)Ｒ恍缘囊锖吞结?，以正常人外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheralbloodmononuclearcells，PBMCs)抽提的RNA為模板，R

7、T-PCR擴(kuò)增出長(zhǎng)度為205bp的目的片段，定向克隆入pMD18-T載體，構(gòu)建了pMD18-T-BAFF克隆載體作為標(biāo)準(zhǔn)模板，通過(guò)熒光強(qiáng)度達(dá)到一定閾值時(shí)的循環(huán)數(shù)來(lái)定量起始模板。 結(jié)果表明，此方法的動(dòng)態(tài)檢測(cè)范圍為104～109拷貝/μgRNA(r2≥0.996)，內(nèi)參GAPDH的動(dòng)態(tài)檢測(cè)范圍為103～108拷貝/μgRNA(r2≥0.998)；對(duì)低值的批內(nèi)、批間的重復(fù)性分別為17.68％和24.33％，高值的批內(nèi)、批間的重復(fù)性分別

8、為5.32％和8.12％。成功建立了人BAFF基因表達(dá)含量的熒光定量檢測(cè)方法，檢測(cè)結(jié)果可用絕對(duì)拷貝數(shù)表示，定量準(zhǔn)確可靠。這種方法快速、簡(jiǎn)便，適合大規(guī)模的常規(guī)檢測(cè)和臨床試驗(yàn)。 二、B細(xì)胞活化因子與系統(tǒng)性紅斑狼瘡關(guān)聯(lián)性的臨床初探 在許多SLE的動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)高濃度的血清BAFF蛋白水平與SLE的發(fā)病密切相關(guān)，而高濃度的血清BAFF蛋白是否來(lái)源于高表達(dá)的BAFF基因還不清楚。在這部分研究中，以商品化的抗BAFF單克隆、多克隆抗

9、體及BAFF標(biāo)準(zhǔn)品，自行建立檢測(cè)血清BAFF蛋白水平的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)方法，對(duì)59例相對(duì)穩(wěn)定的SLE患者和40例正常健康獻(xiàn)血者的血清BAFF水平、免疫球蛋白(IgG、IgA、IgM)濃度、自身抗體(抗雙鏈DNA抗體)滴度進(jìn)行檢測(cè)，比較SLE患者的血清BAFF蛋白水平與免疫球蛋白濃度、自身抗體滴度的相關(guān)性。并結(jié)合已建立的檢測(cè)BAFF基因表達(dá)水平的熒光定量RT-PCR方法，定量檢測(cè)上述59例SLE患者和40例正常人外周血PBM

10、Cs中BAFF基因表達(dá)水平，比較BAFF基因水平與血清水平的關(guān)聯(lián)性，聯(lián)合核酸(mRNA)和蛋白質(zhì)水平來(lái)分析BAFF的異常表達(dá)與SLE發(fā)病機(jī)制的關(guān)聯(lián)性。 結(jié)果顯示，與正常健康人相比，59例病情相對(duì)穩(wěn)定的SLE患者的血清BAFF蛋白含量是明顯升高的，并伴隨著血清IgG濃度、抗雙鏈DNA(ds-DNA)抗體滴度的升高。而且該59例SLE患者中有39例(66％)外周血PBMCs中BAFFmRNA表達(dá)含量明顯升高，該類(lèi)SLE患者的BAFF

11、血清蛋白質(zhì)水平與基因水平有著明顯的正相關(guān)性。提示在BAFF是SLE發(fā)病的主要調(diào)控元件，BAFF基因表達(dá)的異常增多將會(huì)引發(fā)SLE的產(chǎn)生。高濃度的BAFF血清蛋白是一個(gè)明顯的SLE的免疫病理特征，其對(duì)自身反應(yīng)性B細(xì)胞的活化、促進(jìn)特異性自身抗體的產(chǎn)生都起著重要作用。 三、BAFF基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制的研究 該文已經(jīng)從核酸和蛋白質(zhì)水平探討了BAFF的異常表達(dá)在SLE發(fā)病過(guò)程中的作用，但還缺乏從轉(zhuǎn)錄水平揭示BAFF作用實(shí)質(zhì)的研究。在這

12、部分中，研究根據(jù)Genebank中的人BAFF基因上游5’側(cè)翼區(qū)-1320～-300bp的片段，以程序DNAassist1.0模擬分析該序列可能存在的主要核因子位點(diǎn)，選擇設(shè)計(jì)出5個(gè)不同長(zhǎng)短的啟動(dòng)子，即-550～-300bp、-756～-300bp、-906～-300bp、-1218～-300bp、-1320～-300bp，及其對(duì)應(yīng)的上、下游引物。并以正常人全血基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增、定向克隆入含氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶(CAT)報(bào)告基

13、因的pCAT3-Enhancer載體，構(gòu)建出不同長(zhǎng)度5’系列缺失的重組體。轉(zhuǎn)化入大腸桿菌JM109以擴(kuò)增，酶切、測(cè)序鑒定后，抽提質(zhì)粒DNA并定量，培養(yǎng)人骨髓白血病細(xì)胞株：HL-60，采用Fugene6轉(zhuǎn)染試劑，將各重組體質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染入靶細(xì)胞中培養(yǎng)48小時(shí)，對(duì)細(xì)胞裂解物進(jìn)行蛋白定量，用CAT報(bào)告基因ELISA檢測(cè)試劑盒測(cè)定CAT的活性，并比較上述不同長(zhǎng)短啟動(dòng)子的活性，找出高活性的正常BAFF基因啟動(dòng)序列。 該研究還將高活性的BA

14、FF重組啟動(dòng)子轉(zhuǎn)染入HL-60細(xì)胞中，培養(yǎng)24小時(shí)后，加入不同濃度的細(xì)胞因子：IL-10、IL-4、IFN-γ，及重組BAFF(rBAFF)分子，對(duì)細(xì)胞裂解物進(jìn)行蛋白定量，用CAT報(bào)告基因ELISA檢測(cè)試劑盒測(cè)定CAT的活性，觀察其轉(zhuǎn)錄活性的變化，探討不同細(xì)胞因子對(duì)BAFF基因啟動(dòng)子活性的影響。 結(jié)果表明，經(jīng)酶切、測(cè)序鑒定，5個(gè)不同長(zhǎng)短的BAFF重組啟動(dòng)子均與Genebank中的序列一致，人BAFF基因啟動(dòng)片段：-1320～-3

15、00bp、-906～-300bp具有較強(qiáng)的啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄活性，-550～-300bp的啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄活性最低。IFN-γ、IL-10和rBAFF可以提高BAFF啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性，而IL-4抑制BAFF啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性。說(shuō)明細(xì)胞因子IL-10、IFN-γ、IL-4、rBAFF可以一定程度的在轉(zhuǎn)錄水平影響B(tài)AFF合成和分泌。 該文構(gòu)建的5個(gè)含有效BAFF基因啟動(dòng)子的重組質(zhì)粒準(zhǔn)確、可靠，而且報(bào)告基因測(cè)活比較活性的方法簡(jiǎn)單、可以定量，是一個(gè)在轉(zhuǎn)錄水