大黃治療慢傳輸型便秘的分子機(jī)制研究.pdf

1、目的：慢傳輸型便秘(slowtransitconstipation，STC)是一類以胃腸動(dòng)力減弱為主要特點(diǎn)的頑固性便秘，其發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，目前尚缺乏深入的認(rèn)識(shí)。大黃是傳統(tǒng)中藥，具有顯著的致瀉和促進(jìn)腸道蠕動(dòng)的作用，但是其具體機(jī)制目前尚不清楚。為了進(jìn)一步探討大黃治療便秘的機(jī)制，在既往研究工作的基礎(chǔ)上，我們應(yīng)用復(fù)方苯乙哌啶建立大鼠慢傳輸型便秘模型，使用大黃治療便秘大鼠后，觀察結(jié)腸神經(jīng)病理學(xué)改變，利用蛋白質(zhì)組技術(shù)篩選和分析便秘大鼠結(jié)腸組織中介

2、導(dǎo)大黃生物學(xué)作用的蛋白質(zhì)分子，從蛋白質(zhì)水平研究便秘的發(fā)生機(jī)制，為臨床防治慢傳輸型便秘及為研究新型治療便秘的藥物篩選作用靶點(diǎn)。 方法：以復(fù)方苯乙哌啶為造模藥物，給藥劑量為8mg/kg體重，建立大鼠慢傳輸型便秘模型。然后飼以含大黃粉的干飼料，劑量為480mg/kg體重，40天后，采用活性炭灌胃法測(cè)定腸道傳輸速度，同時(shí)進(jìn)行結(jié)腸肌電檢測(cè)。然后處死大鼠，取近側(cè)(距盲腸約1cm)及遠(yuǎn)側(cè)(距肛門約2cm)的結(jié)腸組織進(jìn)行HE染色；對(duì)結(jié)腸肌間神經(jīng)

3、叢標(biāo)本，采用組織化學(xué)染色法，顯示大鼠結(jié)腸肌間神經(jīng)叢內(nèi)AchE能神經(jīng)和NOS能神經(jīng)；碘化鋅—鋨酸(ZIO)染色顯示大鼠結(jié)腸神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的ICC。將0.3g結(jié)腸組織(去除漿膜層)在液氮中充分研磨，稱重后按1ml/100mg的比例加入蛋白裂解液，提取大鼠結(jié)腸組織蛋白質(zhì)進(jìn)行雙向凝膠電泳?？捡R斯亮蘭染色及脫色，對(duì)膠上消化后的差異蛋白點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜分析。獲得的肽序列數(shù)據(jù)用Mascot軟件在NCBI的nr數(shù)據(jù)庫(kù)中搜尋。 結(jié)果：(1)便秘組大鼠腸道傳

4、輸速度比正常對(duì)照組明顯減慢，首粒黑便排出時(shí)間為357±24min，較對(duì)照組大鼠顯著延長(zhǎng)(241±37min，p＜0.01)。大黃治療組大鼠腸道傳輸速度與便秘組相比明顯加快，差異顯著(255±15min，P＜0.01)。(2)便秘組大鼠結(jié)腸慢波出現(xiàn)雙向改變，大黃治療后頻率減慢組便秘大鼠結(jié)腸慢波頻率明顯加快(8.62±1.20次/minvs便秘組5.60±1.20次/min，p＜0.01)，振幅減少(0.33±0.05mvvs便秘組0.46

5、±0.05mv，p＜0.01)，波形仍表現(xiàn)為不規(guī)則的近似正弦波樣曲線；頻率加快組便秘大鼠經(jīng)大黃治療后結(jié)腸慢波頻率明顯減慢，(23.2l±3.86次/minvs便秘組30.23±3.86次/min，p＜0.01)，振幅強(qiáng)弱不等(0.19±0.03mvvs便秘組0.20±0.03mv，p＜0.01)，波形較不穩(wěn)定，且出現(xiàn)基線位移。(3)結(jié)腸切片HE染色發(fā)現(xiàn)便秘組大鼠均顯示粘膜慢性炎癥改變。結(jié)腸肌間神經(jīng)叢鋪片組化染色發(fā)現(xiàn)便秘大鼠結(jié)腸肌間神經(jīng)叢

6、內(nèi)膽堿能神經(jīng)分布較稀疏，數(shù)量較少，但胞體增大，染色加深。大黃治療組大鼠結(jié)腸肌間神經(jīng)叢中的膽堿能神經(jīng)分布趨于正常，膽堿能陽性神經(jīng)元較多(陽性細(xì)胞數(shù)25.71±5.36vs便秘組14.32±4.60，p＜0.01；核漿比例0.71±0.21vs便秘組0.58±0.19，p＜0.01)。便秘組大鼠肌間神經(jīng)叢氮能神經(jīng)元分布較稀疏，數(shù)量較少，染色深淺不一，節(jié)間纖維較細(xì)小，染色較淡。大黃治療組大鼠肌間神經(jīng)叢氮能神經(jīng)元數(shù)量增多(陽性細(xì)胞數(shù)11.76±

7、2.31vs便秘組7.10±2.04，p＜0.01；弱陽性細(xì)胞數(shù)0.62±0.45vs便秘組2.21±1.38，p＜0.01)。ZIO染色顯示便秘大鼠結(jié)腸神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)ICC分布不均勻，有的視野ICC密集，突起連接雜亂，有的視野ICC稀少，突起不能相互連接形成網(wǎng)絡(luò)。大黃治療組大鼠結(jié)腸肌間神經(jīng)叢中的ICC分布與正常大鼠類似，ICC突起相互連接形成網(wǎng)絡(luò)，ICC分布比較均勻。(4)利用雙向凝膠電泳(two-dimensionalgelelectr

8、ophoresis，2DE)分析了在不同狀況下大鼠結(jié)腸組織蛋白質(zhì)表達(dá)的差異，在正常大鼠，便秘大鼠和大黃治療大鼠分別檢測(cè)到256個(gè)，293個(gè)和247個(gè)考染的蛋白質(zhì)點(diǎn)。正常大鼠與便秘大鼠之間共有53個(gè)差異點(diǎn)，大黃治療大鼠與便秘大鼠之間共有37個(gè)差異點(diǎn)，正常大鼠與大黃治療大鼠之間共有21個(gè)差異點(diǎn)，我們利用MALDI-TOF-MS鑒定出6個(gè)差異點(diǎn)。(5)慢傳輸型便秘在其發(fā)生和治療的過程中有顯著的蛋白質(zhì)表達(dá)差異。主要差異表達(dá)的蛋白質(zhì)有：肥大細(xì)胞蛋

9、白酶(A1)，非特異性二肽酶(A2)，線粒體脫氫酶前體(A3)，類肌鈣蛋白Calponin(CaP，B1)，組蛋白H2B(B2)，鼠醛酮還原酶蛋白類似物(RAKb蛋白類似物，B3)。A1、A2、A3在便秘大鼠的膠圖中表達(dá)明顯下調(diào)而在大黃治療組大鼠的膠圖中表達(dá)明顯上調(diào)，B1、B2、B3在便秘大鼠的膠圖中表達(dá)明顯上調(diào)而在大黃治療組大鼠的膠圖中表達(dá)明顯下調(diào)。(6)類肌鈣蛋白Calponin(CaP)與胃腸道的運(yùn)動(dòng)狀態(tài)密切相關(guān)，胃腸運(yùn)動(dòng)增強(qiáng)，它

10、們的含量下降，反之則升高。與細(xì)胞能量代謝密切相關(guān)的線粒體琥珀酸脫氫酶、與粘膜免疫密切相關(guān)的肥大細(xì)胞蛋白酶在慢傳輸型便秘大鼠結(jié)腸組織中的表達(dá)均明顯下調(diào)。 結(jié)論：1.慢傳輸型便秘大鼠結(jié)腸壁內(nèi)存在明顯的神經(jīng)病理學(xué)改變及ICC分布和數(shù)量的異常，結(jié)腸傳輸功能障礙可能與結(jié)腸肌間神經(jīng)叢病理改變及ICC分布和數(shù)量的異常有關(guān)。大黃可部分糾正便秘大鼠結(jié)腸膽堿能神經(jīng)、氮能神經(jīng)及ICC的異常，可能是大黃治療慢傳輸型便秘的機(jī)制之一。2.慢波頻率、振幅異常

11、可能是導(dǎo)致慢傳輸型便秘結(jié)腸傳輸減慢的重要因素，大黃可使便秘大鼠結(jié)腸異常的慢波頻率和振幅恢復(fù)，這可能是大黃治療便秘的機(jī)制之一。3.慢傳輸型便秘在其發(fā)生、發(fā)展和大黃治療的過程中有顯著的蛋白質(zhì)表達(dá)差異。4.肥大細(xì)胞蛋白酶、線粒體琥珀酸脫氫酶、二肽酶在慢傳輸型便秘大鼠結(jié)腸組織中的表達(dá)明顯下調(diào)，提示慢傳輸型便秘大鼠結(jié)腸組織免疫反應(yīng)性減弱，線粒體氧化還原功能障礙在慢傳輸型便秘的發(fā)生、發(fā)展中可能起重要作用，慢傳輸型便秘大鼠腸道蛋白質(zhì)的消化、吸收功能可