CGRP調(diào)節(jié)GSK3-β-β-catenin促進MSCs存活及分化的實驗研究.pdf

1、目的:急性心肌梗死后心肌細胞發(fā)生死亡,瘢痕組織增生使心臟收縮功能受損,近年來干細胞移植療法修復梗死的心肌成為研究的熱點,其中MSCs因其自身具有自我更新、增殖及多向分化能力,多個研究表明其在心肌梗死治療中具有顯著療效。但同時也有陰性結(jié)果表明在心肌梗死急性期移植MSCs后,心功能并未得到改善。分析原因認為主要是心肌梗死后的心臟處于氧化應激環(huán)境中,不利于移植的MSCs存活、增殖及分化,極大地減弱了MSCs治療MI的療效。如何提高MSCs的移

2、植存活率成為解決問題的關(guān)鍵。研究者發(fā)現(xiàn)CGRP從旁分泌心肌及血管營養(yǎng)因子、促進血管新生、抗 VSMCs增殖、促進凋亡及抗心肌細胞凋亡等方面減小梗死面積,改善心功能。Wnt廣泛分布于心臟,調(diào)節(jié)心臟的發(fā)育與生長,當心臟處于應激狀態(tài)時被激活,參與心肌梗死后一系列的病理生理變化。調(diào)節(jié)Wnt信號下游GSK-3β磷酸化,促進β-catenin核蓄積可啟動一系列增殖、存活及分化靶基因的表達。本實驗的目的就是研究CGRP是否可調(diào)控MSCs的命運而加強其

3、治療急心心肌梗死的療效,其中涉及的機制是否與GSK-3β/β-catenin信號通路有關(guān)?
　　方法:
　　1.小鼠斷頸處死、剝離股骨及脛骨,不完全 DMEM/F12培養(yǎng)基沖洗骨髓,收集骨髓液,貼壁離心法體外培養(yǎng)、擴增MSCs;流式細胞儀鑒定MSCs表面標記;細胞計數(shù)法繪制MSCs生長曲線。
　　2.實驗組予不同濃度H2O2(400、200、100、50、25μmol/L)處理MSCs2h,對照組不加H2O2,流式細胞

4、儀檢測細胞存活及死亡率,找出誘導MSCs早期凋亡的最佳濃度;實驗組予不同濃度CGRP(10-6、10-7、10-8、10-9、10-10mol/L)預處理MSCs24h,再向各組MSCs中加入適當濃度的H2O2,對照組只加H2O2,2h后MTT法檢測細胞存活;流式細胞儀檢測存活及凋亡率;根據(jù)MTT及流式細胞儀結(jié)果得出有效的CGRP濃度,再以這些濃度的CGRP+適當濃度的H2O2,對照組只予H2O2處理,western blot檢測凋亡相

5、關(guān)蛋白(Bcl2、survivin、caspase3及Bax)的表達。
　　3.實驗組予不同濃度CGRP(10-6、10-7、10-8mol/L)+5-aza誘導MSCs,對照組單獨予5-aza誘導,空白組不予任何處理,4周后RT-PCR檢測Nkx2.5及cTnI表達;流式細胞儀檢測細胞的存活及死亡率。
　　4.實驗組予10-6mol/L CGRP處理 MSCs,對照組予10-6mol/L CGRP+10-6 mol/L C

6、GRP8-37處理 MSCs,空白組不予任何處理, western blot檢測磷酸化的GSK3-β( P-GSK3-β)及β-catenin的表達。
　　結(jié)果:
　　1.體外培養(yǎng)MSCs,24h后懸浮散在分布,體積小而圓。48h可見細胞貼壁,4-5天見部分單個細胞變?yōu)樗笮巍⑷切位蛐切巍?-10天可見細胞形成集落,相互重疊、融合,大部分細胞變?yōu)殚L梭型,見集落中的細胞呈―旋渦狀‖。骨髓源性干細胞傳代24h后可完全貼壁,呈成纖

7、維細胞樣形態(tài)生長;P3代骨髓源性干細胞生長曲線顯示MSCs在24~72h進入快速增殖,約48h進入對數(shù)生長期,第6天后,細胞生長速度減緩,第8天進入平臺期;流式細胞儀檢測骨髓源性干細胞表面標記發(fā)現(xiàn):CD2997.4％,CD9098.0%,CD452.3%。
　　2.1.流式細胞儀檢測不同濃度H2O2干預MSCs,發(fā)現(xiàn)H2O2組存活率均低于對照組(P<0.01),100μM H2O2及200μM H2O2組間存活率差異無統(tǒng)計學意義(

8、P>0.05),其余組間存活率趨勢為:25μM H2O2>50μM H2O2>100μM H2O2、200μM H2O2>400μM H2O2(P<0.01);對照組(2.867±0.145)早期凋亡率低于25μM H2O2(7.000±0.551),50μM H2O2(7.500±0.289)及100μM H2O2(9.367±0.233)各實驗組(P<0.01),但與200μM H2O2(3.533±0.233)及400μM H2O

9、2(3.733±0.252)兩組間比較無統(tǒng)計學差異(P>0.05),100μM H2O2組早期凋亡率高于各實驗組(P<0.01);對照組晚期凋亡率+死亡率均小于H2O2組(P<0.01),50μM H2O2組晚期凋亡率+死亡率與100μM H2O2組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),其余組間晚期凋亡率+死亡率趨勢為:25μM H2O2<50μM H2O2、100μM H2O2<200μM H2O2<400μM H2O2(P<0.01

10、)。根據(jù)統(tǒng)計學分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)當H2O2濃度為100μmol/L時是誘導MSCs早期凋亡的最佳濃度。
　　2.2.OD490檢測及流式細胞儀檢測不同濃度CGRP+100μM H2O2+MSCs,發(fā)現(xiàn)各CGRP組OD值均大于對照組(P<0.01);隨著CGRP濃度升高,OD值逐漸增大(10-6M CGRP組>10-7M CGRP組>10-8M CGRP組>10-9M CGRP組)(P<0.01),10-9M CGRP與10-10M CG

11、RP組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。流式細胞儀結(jié)果顯示隨著CGRP濃度的升高,存活率逐漸提高(10-6M CGRP組>10-7M CGRP組>10-8M CGRP組>10-9M CGRP組)(P<0.01),10-9M與10-10M CGRP組間無統(tǒng)計學差異(P>0.05),與MTT結(jié)果具有一致性。
　　2.3.Western blot檢測不同濃度CGRP+100μM H2O2各組凋亡相關(guān)蛋白表達,結(jié)果發(fā)現(xiàn)CGRP組抗凋

12、亡蛋白(survivin, Bcl2)表達均高于對照組(P<0.01),CGRP組中隨著 CGRP濃度的增加,抗凋亡蛋白的表達增加( P<0.01)。對照組凋亡蛋白(Caspase3, Bax)表達均高于CGRP組(P<0.01),隨著CGRP濃度的增加,凋亡蛋白的表達減少。且CGRP組Bcl2/Bax均>1,而對照組Bcl2/Bax<1。
　　3.1.RT-PCR法檢測各誘導分化組,發(fā)現(xiàn)4W時10-6 M CGRP及10-7 M

13、 CGRP聯(lián)合5-aza處理組較單獨使用5-aza處理組和空白組Nkx2.5及cTnI表達量多(P<0.01),10-8M CGRP+5-aza處理組與5-aza處理組和空白組Nkx2.5及cTnI表達量無統(tǒng)計學差異(P>0.05),5-aza處理組Nkx2.5的表達較空白組多(P<0.01),而5-aza處理組cTnI的表達卻與空白組無差異性(P>0.05)。CGRP+5-aza組之間比較,發(fā)現(xiàn)隨著 CGRP濃度的上升,Nkx2.5及

14、cTnI表達量濃度依賴性增加(P<0.01)。
　　3.2流式細胞儀檢測各組細胞存活及凋亡率,結(jié)果發(fā)現(xiàn)空白組細胞存活率高于CGRP+5-aza組及5-aza組(P<0.01),而晚期凋亡率+死亡率低于CGRP+5-aza組及5-aza組(P<0.01);CGRP+5-aza組細胞存活率高于5-aza組(P<0.01),而晚期凋亡率+死亡率低于5-aza組(P<0.01);CGRP+5-aza組間比較,發(fā)現(xiàn)隨著CGRP濃度的上升,細

15、胞存活率遞增(P<0.01),而晚期凋亡率+死亡率呈濃度依賴性降低(P<0.01)。
　　4.Western blot檢測 CGRP處理組、阻斷劑組( CGRP+CGRP8-37)及對照組P-GSK3-β及β-catenin的表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn)CGRP處理組P-GSK3-β及β-catenin蛋白表達高于對照組( P<0.01),以抑制劑CGRP8-37處理后,P-GSK3-β及β-catenin蛋白表達降低,且低于對照組( P<0.

16、01)。
　　結(jié)論:
　　1.采用貼壁培養(yǎng)法可成功獲取高純度,狀態(tài)良好的MSCs。
　　2.100μM H2O2是誘導MSCs早期凋亡的最佳濃度;CGRP呈濃度依賴性抗H2O2誘導 MSCs凋亡;CGRP抗 H2O2誘導 MSCs凋亡的主要機制是上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl2、survivin以及下調(diào)凋亡蛋白Caspase3、Bax的表達。
　　3.高劑量的CGRP可促進MSCs向心肌細胞分化,并抑制5-aza的細胞毒作