BMP4上調(diào)神經(jīng)細(xì)胞膽堿能表達與治療老年癡呆模型大鼠的實驗研究.pdf

1、阿爾茨海姆病(Alzheimer’sdisease，AD)是一種神經(jīng)變性性疾病。AD發(fā)病機制中較為公認(rèn)的是中樞神經(jīng)膽堿能系統(tǒng)損傷學(xué)說。本研究組以前的研究表明骨形態(tài)發(fā)生蛋白4(Bonemorphogeneticprotein4，BMP4)可在離體條件下誘導(dǎo)成年大鼠海馬區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞的膽堿能分化，并在在體條件下上調(diào)該區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的膽堿能表達。但BMP4是否僅誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞的膽堿能分化，對神經(jīng)元的膽堿能表達是否也具有上調(diào)作用，尚不了解。通過腦內(nèi)海

2、馬齒狀回注入BMP4上調(diào)該區(qū)神經(jīng)細(xì)胞膽堿能表達，是否對AD模型大鼠具有治療作用，國內(nèi)外尚未見報道。 目的：通過觀察BMP4對離體培養(yǎng)的大鼠海馬區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞的分化和神經(jīng)元的膽堿能表達的影響，以進一步了解BMP4對神經(jīng)干細(xì)胞膽堿能誘導(dǎo)分化作用和明確對神經(jīng)元膽堿能表達是否具有上調(diào)作用；通過將BMP4注入成年大鼠海馬齒狀回區(qū)，進一步了解BMP4體內(nèi)對成年大鼠海馬齒狀回區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的膽堿能表達的作用；通過將BMP4注入海馬齒狀回區(qū)，了解其對

3、AD模型大鼠是否具有治療作用。 方法：(1)從幼齡SD大鼠海馬區(qū)分離并培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞，并行Nestin免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定。在培養(yǎng)液中加入或不加入BMP4，用ChAT免疫細(xì)胞化學(xué)染色及FITC標(biāo)記的流式細(xì)胞檢測法，鑒定膽堿能神經(jīng)細(xì)胞。(2)從胎齡SD大鼠海馬及大腦皮層分離并培養(yǎng)神經(jīng)元，并行MAP2免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定。在培養(yǎng)液中加入或不加入BMP4，用ChAT免疫細(xì)胞化學(xué)染色及FITC標(biāo)記的流式細(xì)胞檢測法，鑒定膽堿能神經(jīng)細(xì)胞。(

4、3)在腦立體定位儀下，將BMP4或NS注入成年大鼠左側(cè)海馬齒狀回，28天后取海馬齒狀回腦組織，行ChAT免疫組化染色，用Image-prog-plus圖像分析系統(tǒng)測量海馬齒狀回ChAT陽性細(xì)胞面積，數(shù)據(jù)采用STATA7.0軟件進行t檢驗。(4)在腦立體定位儀下，離斷成年大鼠左側(cè)穹隆海馬傘，建立AD模型。將BMP4或NS注入AD模型大鼠手術(shù)側(cè)海馬齒狀回區(qū)，28天后用Mirros水迷宮檢測大鼠空間記憶行為；并取海馬齒狀回腦組織行ChAT免疫

5、組化染色。用Image-prog-plus圖像分析系統(tǒng)測量海馬齒狀回ChAT陽性細(xì)胞面積，數(shù)據(jù)采用STATA7.0軟件進行t檢驗。 結(jié)果：(1)從幼鼠腦海馬區(qū)分離出的細(xì)胞具有典型神經(jīng)干細(xì)胞的形態(tài)、增殖及免疫學(xué)特征。加入BMP4組的ChAT陽性細(xì)胞比率顯著高于未加BMP4的對照組(26.64±1.47％；13.42±1.33％，P＜0.01)。流式細(xì)胞術(shù)也測得BMP4組的ChAT陽性細(xì)胞比率高于未加BMP4的對照組(23.42％、

6、7.79％)。(2)從胎鼠腦海馬和大腦皮層區(qū)分離出的細(xì)胞具有典型神經(jīng)元的形態(tài)和免疫學(xué)特征。加入BMP4組的ChAT陽性細(xì)胞比率顯著高于未加BMP4的對照組(13.3±1.37％；6.44±0.81％，P＜0.01)。流式細(xì)胞術(shù)也測得BMP4組的ChAT陽性細(xì)胞比率高于未加BMP4的對照組(11.48％、4.92％)(3)ChAT免疫組織化學(xué)染色顯示：BMP4組大鼠注藥側(cè)海馬齒狀回的ChAT陽性細(xì)胞面積顯著大于對側(cè)(194.78±22.3

7、3μm2；158.03±36.22μm2，P＜0.01)。NS對照組大鼠雙側(cè)海馬齒狀回的ChAT陽性細(xì)胞面積無顯著差異(142.78±26.58μm2；143.76±18.76μm2，P＞0.05)。而BMP4組大鼠注藥側(cè)海馬齒狀回的ChAT陽性細(xì)胞面積顯著大于NS對照組的注藥側(cè)(194.78±22.33μm2；142.78±26.58μm2，P＜0.01)。(4)Mirros水迷宮實驗測得穹隆海馬傘離斷的AD模型大鼠尋找平臺時間和路程

8、顯著長于正常組[(37.21±19.49s、903.09±707.04；13.95±8.38s、290.46±156.60，P＜0.01)]；ChAT免疫組化染色顯示AD模型組大鼠手術(shù)側(cè)海馬齒狀回ChAT陽性細(xì)胞面積顯著小于正常組(68.62±24.73μm2；144.65±24.27μm2，P＜0.01)。BMP4-AD組大鼠尋找平臺所需時間和路程顯著小于NS-AD組[(18.25±12.26s、445.26±347.18；40.21

9、±18.69、1012.34±759.13，P＜0.01)]；ChAT免疫組化染色顯示：BMP4-AD組注藥側(cè)海馬齒狀回ChAT陽性細(xì)胞面積顯著大于NS-AD組(104.47±8.63μm2；69.31±24.97μm2，P＜0.01)。 結(jié)論：(1)從幼齡大鼠海馬區(qū)可分離出具有神經(jīng)干細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征和免疫學(xué)標(biāo)志的細(xì)胞；BMP4可在體外誘導(dǎo)該神經(jīng)干細(xì)胞的膽堿能分化。(2)從胎齡大鼠海馬及大腦皮層可分離出具有神經(jīng)元形態(tài)學(xué)特征和免疫學(xué)