JAK抑制劑AG490及Survivin基因表達在卵巢上皮性癌發(fā)展中的意義.pdf

1、目的： 1.探討JAK--STAT(Janus激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活子)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的抑制劑AG490在人卵巢癌上皮細胞株SKOV3中對survivin(存活素)基因表達的影響。 2.探討survivin基因?qū)δ[瘤細胞增殖、凋亡影響的作用機制，以了解survivin在卵巢上皮性癌發(fā)展中的作用。 3.探討AG490在抗卵巢腫瘤方面的研究價值和臨床應(yīng)用前景。 研究表明JAK--STAT途徑廣泛參與細胞的增殖

2、、分化以及免疫調(diào)節(jié)等過程，是多種細胞因子和生長因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要途徑[1]。在正常細胞中，激活STATS是一個瞬時的過程，而在癌癥細胞中，STATS蛋白被異常持續(xù)激活，其中STAT1和STAT2是自然免疫所必需，而STAT4和STAT6在獲得免疫中發(fā)揮作用，STAT1的功能主要與生長抑制有關(guān)，而STAT3和STAT5可通過自身活化的增強，通過下游的基因表達的變化來抑制凋亡或誘導(dǎo)細胞增生作用參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，如bcl-2，細胞周期素及本

3、文研究的survivin基因等等。 方法：我們以代表卵巢上皮性癌的細胞株SKOV3做細胞培養(yǎng)，加用AG490處理后，用MTT比色試驗檢測細胞生長受抑制的情況，流式細胞儀檢測細胞凋亡情況及細胞周期變化的情況，最后以免疫組化法檢測STAT3、p-STAT3與survivin的表達變化情況。 SKOV3細胞常規(guī)培養(yǎng)于含10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，取對數(shù)生長期的SKOV3細胞加不同濃度的AG490藥物培養(yǎng)。按AG490藥

4、物濃度分組，分為0μmol/L組即空白對照組、20μmol/L處理組、40μmol/L處理組、80μmol/L處理組和160μmol/L處理組，各個濃度處理組均于12小時、24小時、48小時時間點用四唑鹽比色試驗(MTT比色試驗)檢測細胞生長情況，計算細胞生長抑制率；用流式細胞儀(Flow Cytometry，F(xiàn)CM)檢測用0μmol/L組、20μmol/L處理組、40μmol/L處理組處理前后細胞凋亡的情況以及細胞周期變化的情況。免疫

5、組化法分為對照組和40μmol/L藥物處理組，于藥物處理的24小時檢測STAT3、p-STAT3與survivin的表達率。 結(jié)果：顯微鏡下每日觀察對照組和各實驗組細胞數(shù)量、大小和形態(tài)上的變化。正常情況下：顯微鏡下見SKOV3細胞呈單層貼壁生長，細胞長梭形或多角形，胞核圓形或橢圓形，胞漿透亮。經(jīng)AG490處理后12小時，SKOV3細胞胞體開始變圓，胞漿透亮度下降，顆粒感增強，部分細胞脫落呈懸浮狀，24小時細胞形態(tài)學(xué)改變更加明顯，

6、多數(shù)細胞呈圓形，脫落并成懸浮狀態(tài)的細胞增多，并可見細胞碎片，48小時幾乎80％以上的細胞呈圓形，培養(yǎng)液中可見大量懸浮細胞。 MTT比色試驗檢測不同濃度(0-160μmol/L)AG490處理組SKOV3細胞在不同的時間點12小時、24小時、48小時生長情況，均出現(xiàn)一定程度的抑制細胞增殖和誘導(dǎo)細胞凋亡的現(xiàn)象，且這種抑制作用呈時間及濃度依賴性。AG490處理細胞后出現(xiàn)細胞增殖活性降低，20，40，80和160μmol/L處理組48小

7、時細胞的生長抑制率分別為38.24％，53.08％，75.54％，84.25％，細胞生長減慢，細胞數(shù)減少。流式細胞術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，AG490使SKOV3細胞周期阻滯于G2/M期，S期和G0/1期細胞數(shù)減少，細胞凋亡率明顯增加；加用AG490后24小時就可看到明顯的凋亡峰。48小時空白對照組的凋亡率約為5％，40μmol/L藥物處理組凋亡率可達33％，有顯著性差異(P<0.05)。 免疫組化法可以看到AG490可通過抑制JAK酶的活性

8、從而抑制了STAT3的活化，STAT3的表達率由76.29％上升到80.66％，無顯著性差異(P>0.05)，但是降低了其活化形式p-STAT3的表達，表達率由58.95％下降為20.67％，從而降低了survivin的表達，表達率由56.91％下降為16.24％，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。表明survivin的表達隨著STAT3活化被抑制和p-STAT3的表達率下降而下降。 結(jié)論：本實驗藥物AG490為JAK酶特異

9、性抑制劑，通過抑制JAK酶的活性，可有效的阻斷其下游的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活子STATS的活化，影響JAK-STAT信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)和表達，從而使細胞的增殖受到抑制，細胞的凋亡率下降。在卵巢上皮性癌SKOV3細胞系中，AG490通過抑制JAK酶的活性，阻斷STAT信號的活化，即降低了p-STAT3的表達水平，進而降低了其下游凋亡抑制蛋白survivivn的表達，促進腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤細胞的異常增殖，說明survivin可能是卵巢上皮性癌的