TPO+HGF+Il-3方案對(duì)人骨髓源性肝干細(xì)胞各亞群體外擴(kuò)增的促進(jìn)作用.pdf

1、在從事骨髓干細(xì)胞的相關(guān)研究中，某些實(shí)驗(yàn)研究證明了骨髓中部分干細(xì)胞具有向肝系細(xì)胞分化的潛能，于是就提出了“骨髓源性肝干細(xì)胞(bonemarrow-derived liver stem cell)”這一概念。骨髓源性肝干細(xì)胞(BMDLSC)是肝干細(xì)胞的肝外重要來(lái)源，能夠在特定條件下分化成為肝細(xì)胞樣細(xì)胞甚至是肝細(xì)胞，進(jìn)而在肝臟的修復(fù)與重建中扮演重要的角色。就目前而言，自體骨髓干細(xì)胞移植治療肝硬化作為治療肝硬化的一種新方法，是世界上最前沿、最熱

2、門(mén)的醫(yī)療技術(shù)之一。其原理是將患者健康的骨髓分離出干細(xì)胞，并將分離純化干細(xì)胞經(jīng)肝動(dòng)脈或門(mén)靜脈再回輸至病肝內(nèi)，并讓這些干細(xì)胞在肝內(nèi)“落戶(hù)”發(fā)揮功能。在臨床工作中，肝移植面臨著肝源短缺、費(fèi)用昂貴等問(wèn)題，而骨髓源性肝干細(xì)胞的自體移植，則具有取材方便，易于體外擴(kuò)增，而且不存在組織配型及免疫排斥等優(yōu)勢(shì)。但是，人體骨髓中的間充質(zhì)干細(xì)胞含量極少，大約每104～105個(gè)單個(gè)核細(xì)胞中含有1個(gè)間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)[1]，而臨床應(yīng)用骨髓干細(xì)胞移植治療疾病則需

3、要具備一定的數(shù)量以及較高的純度，因此，人骨髓源性肝干細(xì)胞的體外純化培養(yǎng)擴(kuò)增、鑒定和各個(gè)干細(xì)胞亞群擴(kuò)增情況的了解分析就顯得尤為重要。
　　 在體外誘導(dǎo)MSC分化成為肝樣細(xì)胞甚至肝細(xì)胞，一些維持細(xì)胞功能、誘導(dǎo)細(xì)胞分化的刺激因素是必不可少的，例如生長(zhǎng)激素、細(xì)胞因子、細(xì)胞外基質(zhì)或者與其他類(lèi)型的細(xì)胞共同培養(yǎng)。目前，關(guān)于骨髓源性肝干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)模式國(guó)內(nèi)外尚未形成統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。各種培養(yǎng)模式所用的細(xì)胞因子不同，有單一使用某種細(xì)胞因子，也有聯(lián)

4、合多種細(xì)胞因子的。本研究小組探討了
　　 TPO+HGF+IL-3組合培養(yǎng)方案，建立了一種穩(wěn)定的分離純化并能有效擴(kuò)增干細(xì)胞的途徑，為獲得大量純化的骨髓源性肝干細(xì)胞并進(jìn)而研究其作為種子細(xì)胞治療疾病提供了相關(guān)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（Hepatocyte Growth Factor，HGF）為肝再生的特異性因子，與其受體c-met相結(jié)合而起作用，特別是在細(xì)胞密度較低的情況下，肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子對(duì)肝干細(xì)胞的遷移、增殖起基礎(chǔ)作用，能有效的誘

5、導(dǎo)肝干細(xì)胞分化為肝細(xì)胞，并且此作用效果與HGF的濃度有關(guān)系。白細(xì)胞介素-3(Interleukin-3，IL-3)和血小板生成素(Thrombopoietin，TPO)等亦在骨髓源性肝干細(xì)胞的增殖分化誘導(dǎo)中起著重要的調(diào)節(jié)性作用。
　　 迄今為止，科研人員尚未發(fā)現(xiàn)可直接鑒定骨髓源性肝干細(xì)胞的特征性表面標(biāo)志，其在骨髓干細(xì)胞衍生過(guò)程中的具體譜系定位也不太清楚，但是相關(guān)研究表明表達(dá)CD90、CD105、CD117、CD184、CD326

6、細(xì)胞表型的是具有肝干細(xì)胞潛能的細(xì)胞亞群[2、3]。
　　 本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用非連續(xù)性梯度密度離心法（Percoll分離液）從人骨髓中分離出富含目標(biāo)細(xì)胞的細(xì)胞組分。采用TPO+HGF+IL-3的聯(lián)合培養(yǎng)方案，骨髓源性肝干細(xì)胞的體外擴(kuò)增調(diào)整初始擴(kuò)增的細(xì)胞密度為2.50×106/ml。實(shí)驗(yàn)組為添加有血小板生成素(TPO)50ng/ml、促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素(HGF)40μg/ml、白細(xì)胞介素-3(IL-3)10ng/ml的高糖DMEM培養(yǎng)基體系，對(duì)

7、照組則不含TPO+HGF+IL-3，倒置相差顯微鏡下觀察誘導(dǎo)分化細(xì)胞胞體大小、形態(tài)、核仁數(shù)目及核漿比例的變化，分別在第1、7、14天，計(jì)算培養(yǎng)細(xì)胞總數(shù)，并采用流式細(xì)胞技術(shù)分別測(cè)算表達(dá)CD90、CD105、CD117、CD184、CD326的人骨髓源性肝干細(xì)胞各亞群的比例變化及增長(zhǎng)倍數(shù)等。建立了一種能穩(wěn)定分離、純化、培養(yǎng)并有效擴(kuò)增骨髓多能前體干細(xì)胞的方法，為獲得足量的純化的骨髓源性肝干細(xì)胞并進(jìn)而研究其作為種子細(xì)胞治療多種臨床疾病提供了實(shí)驗(yàn)

8、基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示表達(dá)CD90、CD105、CD117、CD184、CD326的人骨髓源性肝干細(xì)胞各亞群的數(shù)量變化在第7天分別為4.94、4.89、6.70、5.72、5.03倍，及第14天數(shù)量增長(zhǎng)倍數(shù)為7.60、7.76、11.70、21.38、8.12倍。從數(shù)據(jù)分析中可見(jiàn)實(shí)驗(yàn)組中的各個(gè)亞群均有穩(wěn)步的增長(zhǎng)，其中以表達(dá)CD184的亞群增加最為迅速。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了TPO+HGF+IL-3方案能夠穩(wěn)定培養(yǎng)和擴(kuò)增骨髓源性肝干細(xì)胞，此組合培養(yǎng)方案

9、對(duì)人骨髓源性肝干細(xì)胞各亞型的體外擴(kuò)增有明顯的促進(jìn)效果，其中以表達(dá)CD184亞群的擴(kuò)增效果最為明顯。
　　 本課題的特點(diǎn)及意義:采用了TPO+HGF+IL-3細(xì)胞體外培養(yǎng)方案，促進(jìn)骨髓源性肝干細(xì)胞的擴(kuò)增，選擇了五個(gè)人骨髓源性肝干細(xì)胞的亞群，了解不同的亞群在此方案的作用下數(shù)量有何變化及關(guān)系，探討了此方案下不同的亞群總體數(shù)量及比例的變化，增長(zhǎng)最明顯的亞群，在臨床應(yīng)用方面，為進(jìn)一步的人體應(yīng)用骨髓源性肝干細(xì)胞的治療相關(guān)疾病的提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)

10、。
　　 材料和方法:
　　 1.骨髓源性肝干細(xì)胞的分離純化培養(yǎng)
　　 1.1骨髓來(lái)源
　　 所取骨髓量約10ml至15ml，這些骨髓取自2011年05月至2011年10月之間南方醫(yī)科大學(xué)附屬南方醫(yī)院骨科手術(shù)患者（無(wú)血液系統(tǒng)疾?。瑯?biāo)本為隨機(jī)選取骨科手術(shù)，取髂骨內(nèi)所含骨髓七份;健康成人髂前上棘骨髓一份;最終納入實(shí)驗(yàn)的總共有八份。
　　 1.2主要試劑
　　 percoll分離液（pharm

11、acia），高糖DMEM(GIBCO)，PBS緩沖液(newprobe)，促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素（HGF，吉林華康），促血小板生長(zhǎng)素(TPO，peprotech)，白細(xì)胞介素3(IL-3，peprotech)，熒光標(biāo)記抗人抗體CD90-FITC、CD105-APC、CD117-PE、CD184-APC、CD326-PE(eBioscience)、胎牛血清(FCS，Hyclone)、0.25％胰酶(Hyclone)、青霉素和鏈霉素。
　　

12、 1.3實(shí)驗(yàn)方法
　　 1.3.1目標(biāo)細(xì)胞的分離
　　 使用percoll作為分離液，分成60％(1.077 g/ml)、50％(1.067 g/ml)、40％(1.056 g/ml)、30％(1.043 g/ml)四個(gè)密度梯度，取新鮮抗凝人骨髓10-15ml，經(jīng)percoll液不連續(xù)密度梯度離心分離，選取密度為40％-50％之間的細(xì)胞組分。
　　 1.3.2目標(biāo)細(xì)胞的培養(yǎng)
　　 調(diào)整細(xì)胞起始的培養(yǎng)密度為

13、2.50×106個(gè)/ml，培養(yǎng)環(huán)境為1ml，培養(yǎng)面積為2cm2。實(shí)驗(yàn)組為:加入血小板生成素(TPO)50ng/ml、促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素(HGF)40μg/ml、白細(xì)胞介素-3(IL-3)10ng/ml含10％血清的高糖DMEM培養(yǎng)基體系;對(duì)照組則為含10％血清的高糖DMEM培養(yǎng)基體系。細(xì)胞于37℃、5％CO2孵育箱中培養(yǎng)，每3～4 d更換一次培養(yǎng)基。
　　 1.3.3細(xì)胞計(jì)數(shù)及形態(tài)學(xué)變化
　　 分別于培養(yǎng)的第1、7、14天，

14、將細(xì)胞計(jì)數(shù)板，蓋玻片用10％的酒精擦干凈。將蓋玻片蓋子計(jì)數(shù)板上。常規(guī)準(zhǔn)備細(xì)胞懸液，吹勻，抽取少量，由蓋玻片邊緣加入。計(jì)算四大格的細(xì)胞數(shù)。按如下公式:細(xì)胞數(shù)/ml=四大格/4×104×稀釋倍數(shù)。
　　 倒置相差顯微鏡下觀察誘導(dǎo)分化培養(yǎng)細(xì)胞胞體大小、形態(tài)、核仁數(shù)目及核漿比例的變化。
　　 2.人骨髓源性肝干細(xì)胞各細(xì)胞亞型的擴(kuò)增情況
　　 2.1流式細(xì)胞儀檢測(cè)各亞群的數(shù)量變化
　　 采用上述培養(yǎng)方案后，分別于培

15、養(yǎng)的第1、7、14天，用胰酶消化貼壁細(xì)胞后，計(jì)數(shù)，在100μl環(huán)境中按5×105個(gè)細(xì)胞分別加入5μl抗人CD90-FITC、5μl抗人CD105-APC、20μl抗人CD117-PE、20μl抗人CD184-APC、20μl抗人CD326-PE，于冰上避光孵育30 min，600 g離心3 min，去除上清，后用PBS吹打均勻細(xì)胞，再次600g離心3min，清洗2次，1％多聚甲醛固定;迅速行流式細(xì)胞儀(BD公司FACS Caliber)

16、檢測(cè)CD90、CD105、CD117、CD184、CD326細(xì)胞所占的百分率。
　　 2.2數(shù)據(jù)處理
　　 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，非參數(shù)秩和檢驗(yàn);結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示;P＜0.05差別有顯著意義。
　　 結(jié)果:
　　 1.顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)改變
　　 培養(yǎng)初期，相差顯微鏡下實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)明顯差別，細(xì)胞均成纖維樣生長(zhǎng)，有一定的方向性，集落呈旋渦狀和火焰狀

17、，但實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞生長(zhǎng)較旺盛。培養(yǎng)中期，實(shí)驗(yàn)組原長(zhǎng)梭型細(xì)胞逐漸變圓，細(xì)胞集落間相互融合成單層，長(zhǎng)滿整個(gè)培養(yǎng)瓶，細(xì)胞排列呈平行狀或漩渦狀。對(duì)照組細(xì)胞到培養(yǎng)后期原長(zhǎng)梭型細(xì)胞仍為梭形，但細(xì)胞質(zhì)折光性差，考慮為老化現(xiàn)象。培養(yǎng)后期，傳代培養(yǎng)的細(xì)胞生長(zhǎng)速度較原代培養(yǎng)明顯增快，不再形成細(xì)胞集落，4-5d即可鋪滿瓶底。
　　 2.目標(biāo)細(xì)胞的增長(zhǎng)總數(shù)
　　 培養(yǎng)第7天，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞總數(shù)（106個(gè)）總數(shù)為12.01±0.30，對(duì)照組則為5.12±

18、0.26;培養(yǎng)第14天，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞總數(shù)（106個(gè)）總數(shù)為18.05±0.28，對(duì)照組則為7.05±0.23。
　　 3.骨髓源性肝干細(xì)胞各個(gè)亞群的數(shù)量變化
　　 表達(dá)CD90、CD105、CD117、CD184、CD326的人BMDLSC各亞群的數(shù)量變化在第7天分別為4.94、4.89、6.70、5.72、5.03倍，及第14天數(shù)量增長(zhǎng)倍數(shù)為7.60、7.76、11.70、21.38、8.12倍。實(shí)驗(yàn)組中的各個(gè)亞群均有穩(wěn)

19、步的增長(zhǎng)，其中以CD184的增加最為明顯。
　　 結(jié)論:
　　 1.培養(yǎng)細(xì)胞總數(shù)的穩(wěn)定增長(zhǎng)表明，TPO+HGF+IL-3組合培養(yǎng)方案是穩(wěn)定的純化、培養(yǎng)并有效擴(kuò)增骨髓源性肝干細(xì)胞的方法，此方案能夠有效增加人骨髓源性肝干細(xì)胞的數(shù)量，解決了臨床應(yīng)用細(xì)胞移植所遇到的細(xì)胞數(shù)量不足的問(wèn)題，為進(jìn)一步開(kāi)展肝干細(xì)胞移植提供了方便。
　　 2.骨髓源性肝干細(xì)胞可以作為肝組織工程重要的種子細(xì)胞來(lái)源。骨髓源性肝干細(xì)胞容易獲得，操作較為方