含噻唑烷-4-酮的免疫調節(jié)劑對巨噬細胞和NK細胞作用機制研究.pdf

1、目的：研究含噻唑烷-4-酮的糖類衍生小分子免疫調節(jié)劑（CH1a、CH2a、CH1b和CH2b）對固有免疫中MФ及NK細胞功能的影響；并探討MФ及NK細胞活化可能的信號通路。
　　方法：
　?、儆^察免疫調節(jié)劑在體外對巨噬細胞功能的影響，實驗以無支原體感染的RAW264.7巨噬細胞系為研究對象。首先，利用CyQuant Cell Proliferation Assay觀察免疫調節(jié)劑對LPS處理的RAW264.7巨噬細胞增殖的影響

2、；其次，經(jīng)免疫調節(jié)劑刺激的巨噬細胞吞噬FITC標記的Fluoresbrite YG polystyrene latex beads(0.75-mm Microspheres)檢測其吞噬活性；再次，利用ELISA和RT-PCR方法分別測定培養(yǎng)上清中細胞因子水平（IL-6、IL-8和TNF-α）和細胞內mRNA（IL-6、IL-8和TNF-α）轉錄水平；此外，應用Griess Reagent System和流式細胞技術（FACS）分別對NO

3、和活性氧（ROS）進行了測定，并利用Western blot檢測iNOS的表達水平；最后，利用Western blot分別檢測NF-κBp65和p38MAPK兩條信號通路活化狀態(tài)。
　?、谟^察免疫調節(jié)劑對NK細胞功能的影響，利用磁珠標記法（MACS）從健康人外周血中分離純化NK細胞并對其純度及活度進行測定。首先，CyQuant Cell Proliferation Assay檢測免疫調節(jié)劑對正常和IL-15處理的NK細胞增殖的影響

4、；其次，51Cr-release assay測定NK細胞殺傷活性；再次，ELISA檢測細胞培養(yǎng)上清中IFN-γ和TNF-α的含量；最后，Western blot檢測NK細胞殺傷相關的ERK1/2信號通路的活化狀態(tài)。
　　結果：
　　1、與對照組及CH2a和CH1b相比，CH1a和CH2b可顯著促進LPS活化的RAW264.7的增殖，且可顯著提高巨噬細胞的吞噬活性并顯著促進IL-6、IL-8和TNF-α的分泌及其mRNA的轉錄

5、；提高NO和ROS的水平；促進IκB-α降解和NF-κBp65在核內的轉位，并促進p38MAPK磷酸化。但是，未經(jīng)LPS活化的巨噬細胞經(jīng)CH1a、CH2a、CH1b或CH2b直接刺激后上述結果均不明顯。
　　2、CH1a、CH2a、CH1b和CH2b對正常和IL-15預處理的NK細胞無促進增殖效應；CH1b和CH2b可顯著提高IFN-γ與TNF-α的分泌，并能明顯促進ERK1/2的磷酸化，而這種效應經(jīng)PD098059阻斷后消失。<