SelS保護(hù)ECV-,304-細(xì)胞免于過(guò)氧化氫損傷與窖蛋白-1的關(guān)系研究.pdf

1、目的： 從人脂肪組織中克隆SelS基因片段，構(gòu)建pcDNA3.1-SelS真核表達(dá)載體。將pcDNA3.1-SelS瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株(ECV304)中，分別從mRNA水平及蛋白水平檢測(cè)SelS基因在ECV304細(xì)胞中的表達(dá)。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后將ECV304細(xì)胞分為未轉(zhuǎn)染組、SelS轉(zhuǎn)染組(SelS高表達(dá)組)及空載體轉(zhuǎn)染組，以不同濃度的過(guò)氧化氫( H2O2)損傷后，觀察各組細(xì)胞損傷前后的氧化應(yīng)激指標(biāo)及窖蛋白-1 (Caveol

2、in-1．Cav-1)表達(dá)水平的差異，探討Caveolin-1是否與SelS抗氧化作用有關(guān)。為深入研究SelS內(nèi)皮保護(hù)的作用機(jī)制提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法： 1．采用RT-PCR方法從人脂肪組織中獲取SelS基因片段(79～645bp)，通過(guò)兩次亞克隆將目的基因克隆于pcDNA3.1真核表達(dá)載體中，獲得真核表達(dá)載體質(zhì)粒pcDNA3.1-SelS，并行EcoRI/XhoI酶切鑒定及測(cè)序鑒定。 2．應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)分

3、別將pcDNA3.1-SelS及pcDNA3.1瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至ECV304細(xì)胞中，從而將ECV304細(xì)胞分為SelS轉(zhuǎn)染組及空載體轉(zhuǎn)染組，同時(shí)以未轉(zhuǎn)染組ECV304細(xì)胞作為對(duì)照。以GAPDH為內(nèi)參照半定量檢測(cè)SelS mRNA水平的表達(dá)；以β-actin為內(nèi)參照，Western blot方法檢測(cè)SelS蛋白水平的表達(dá)。 3．各組細(xì)胞分別經(jīng)含有終濃度為0、400、600、800、1000μmol/L，的H2O2的培養(yǎng)液作用6小時(shí)后，四

4、甲基偶氮唑藍(lán)法(MTT)觀察H2O2對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響：取不同濃度各組細(xì)胞上清液，硫代巴比妥酸法測(cè)定丙二醛(MDA)的含量，黃嘌呤氧化酶法測(cè)定超氧化物歧化酶(SOD)的活力。 4．根據(jù)MTT結(jié)果，選取細(xì)胞生存率適度減低的含H2O2濃度800μmol/L，的培養(yǎng)液作用各組細(xì)胞6小時(shí)后，提取各組細(xì)胞總RNA，采用RT-PCR方法檢測(cè)各組細(xì)胞Caveolin-1的mRNA表達(dá)水平。 結(jié)果： 1．從人脂肪組織中提取的總

5、RNA是完整的，SelS基因cDNA測(cè)序結(jié)果與Genebank中的序列(NM-018445)相一致。經(jīng)XhoI和EcoRI酶切及測(cè)序鑒定證實(shí)pcDNA3.1-SelS真核表達(dá)載體質(zhì)粒構(gòu)建成功。 2．RT-PCR、Western blot檢測(cè)證實(shí)SelS在ECV304細(xì)胞中有內(nèi)源性表達(dá)，同時(shí)半定量分析顯示SelS轉(zhuǎn)染組的SelSmRNA及蛋白表達(dá)水平均較未轉(zhuǎn)染組及空載體轉(zhuǎn)染組明顯升高(P<0.01)，未轉(zhuǎn)染組與空載體轉(zhuǎn)染組表達(dá)無(wú)差

6、異(P<0.01)。 3．細(xì)胞生存率(％)：ECV304細(xì)胞暴露于含不同濃度的H2O2的培養(yǎng)液中6小時(shí)后，細(xì)胞生存率明顯下降：在H2O2濃度為800、1000μmol/L時(shí)，SelS轉(zhuǎn)染組(34±10，27±15)的細(xì)胞生存率明顯高于未轉(zhuǎn)染組(32±12，24±9)及空載體轉(zhuǎn)染組(31±14，23±10) (P<0.01)，空載體轉(zhuǎn)染組與未轉(zhuǎn)染組相比差異不顯著(P>0.05)。 4．MDA含量(nmol/mL)：各組細(xì)胞

7、上清液中MDA的含量隨著H2O2濃度的升高而增加；在H2O2濃度為600、800、1000μmol/L時(shí)，SelS轉(zhuǎn)染組的MDA水平(3.50±0.07，6.30±0.07，10.50＋0.08)均低于未轉(zhuǎn)染組(6.40±0.03，10.40±0.11，18.00±0.07)及空載體轉(zhuǎn)染組(5.80±0.08，9.00±0.09，16.40±0.19)，H2O2濃度為1000μmol/L時(shí)差異更為顯著(P<0.05，P<0.05，P<0

8、.01)，空載體轉(zhuǎn)染組與未轉(zhuǎn)染組相比差異不顯著(P>0.05)。 5．SOD活力(U/ml)：各組細(xì)胞上清液中SOD的活力隨著H2O2濃度的升高而減弱；在H2O2濃度為600、800、1000μmol/L時(shí)，SelS轉(zhuǎn)染組的SOD活力(8.34±0.16，7.48±0.87，6.60±1.58)明顯高于未轉(zhuǎn)染組(7.52±0.29，5.70±0.22，4.62±2.33)及空載體轉(zhuǎn)染組(7.12±1.63，6.10±1.78，5

9、.00±1.27)，在H2O2濃度800、1000μmol/L時(shí)升高更為明顯(P<0.05，P<0.01，P<0.01)；空載體轉(zhuǎn)染組與未轉(zhuǎn)染組相比無(wú)差異(P>0.05)。 6．Caveolin-1 mRNA的表達(dá)：ECV304細(xì)胞暴露于含不同濃度H2O2的培養(yǎng)液中6小時(shí)后，與損傷前相比，未轉(zhuǎn)染組(0.74±0.01 vs 0.48+0.01，P<0.01)、SelS轉(zhuǎn)染組(0.67±0.01 vs 0.63±0.01，P<0.

10、05)及空載體轉(zhuǎn)染組(7.12±1.63 vs 0.58±0.01，P<0.01)均明顯升高：H2O2損傷后，SelS轉(zhuǎn)染組(0.67+0.01)明顯低于未轉(zhuǎn)染組(0.74±0.01)(P<0.01)及空載體轉(zhuǎn)染組(7.12±1.63)(P<0.01)，而未轉(zhuǎn)染組與空載體轉(zhuǎn)染組比較無(wú)差異(P>0.05)。 結(jié)論： 1．成功構(gòu)建pcDNA3.1-SelS真核表達(dá)載體，將pcDNA3.1-SelS瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至ECV304細(xì)胞中