TRPC1在糖皮質(zhì)激素抑制成年神經(jīng)干細(xì)胞增殖中的作用與機(jī)理.pdf

1、目的：
　　 糖皮質(zhì)激素(Glucocorticoid，GC)是由腎上腺皮質(zhì)分泌的一類具有神經(jīng)活性的甾體激素，參與學(xué)習(xí)記憶的形成過程。研究證實(shí)GC是應(yīng)激損傷、腦老化、神經(jīng)退行性疾病等學(xué)習(xí)記憶功能障礙的重要發(fā)病原因之一。海馬是GC損傷中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要靶器官之一。文獻(xiàn)報道GC顯著抑制成年大鼠海馬的神經(jīng)干細(xì)胞的增殖，但機(jī)理有待深入探討。外鈣內(nèi)流引起信號通路的激活調(diào)控神經(jīng)發(fā)生的過程，TRPC1介導(dǎo)的外鈣內(nèi)流在胚胎干細(xì)胞的增殖中起重要作

2、用。在成年神經(jīng)干細(xì)胞TRPC1的表達(dá)未見報道。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，CREB磷酸化調(diào)節(jié)成年海馬神經(jīng)發(fā)生的過程；P13K/AKT信號參與神經(jīng)干細(xì)胞的增殖過程，GC通過TRPC1通道對P13K/AKT信號及CREB信號的影響如何，未見文獻(xiàn)報道。因此，深入探討GC損傷神經(jīng)干細(xì)胞增殖的機(jī)理，將為GC損傷學(xué)習(xí)記憶功能的防治具有重要的理論和實(shí)際意義。
　　 方法：
　　 (1)成年神經(jīng)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)，用免疫組化方法進(jìn)行鑒定，反映細(xì)胞具備

3、的多向分化潛能，呈現(xiàn)出神經(jīng)干細(xì)胞的特性；
　　 (2)CCK-8試劑盒和BrdU試劑盒檢測GC對神經(jīng)干細(xì)胞增殖的影響；
　　 (3)實(shí)時定量RT-PCR，Western blot檢測TRPC1-7在神經(jīng)干細(xì)胞上的表達(dá)信號分子CREB、Akt蛋白表達(dá)及磷酸化水平；
　　 (4)用激光共聚焦技術(shù)，將細(xì)胞負(fù)載fura-2后觀測胞內(nèi)Ca2+濃度；
　　 (5)shRNA靶序列的設(shè)計(jì)，慢病毒載體的構(gòu)建和表達(dá)，觀察T

4、RPC1 shRNA基因沉默對成年神經(jīng)干細(xì)胞SOCE和增殖的影響；
　　 (6)TRPC1中和抗體拮抗TRPC1功能對成年神經(jīng)干細(xì)胞SOCE和增殖的影響；
　　 (7)細(xì)胞周期分析和基因序列分析檢測神經(jīng)干細(xì)胞的細(xì)胞周期和基因表達(dá)；
　　 (8)免疫熒光染色方法，觀測TRPC1/SOX2，TRPC1/Orail/STIM1在成年神經(jīng)干細(xì)胞的表達(dá)定位。
　　 結(jié)果：
　　 (1)GC抑制成年神經(jīng)干細(xì)胞

5、的增殖；
　　 (2)TRPC參與干細(xì)胞的增殖；
　　 (3)TRPC1在成年神經(jīng)干細(xì)胞上表達(dá)；
　　 (4)TRPC1在成年海馬SGZ區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞上表達(dá)，GC抑制TRPC1的基因表達(dá)；
　　 (5)SOCE存在于增殖的aNSCs。TRPC1、SOCE的拮抗劑2-APB、Gd3+以及SKF96365能夠抑制TG介導(dǎo)的Ba2+內(nèi)流和aNSCs的增殖；
　　 (6)TRPC1在增殖的aNSCs中表達(dá)，

6、敲除TRPC1，抗體封閉TRPC1的功能明顯的抑制SOCE以及aNSCs的增殖；
　　 (7)抑制TRPC1表達(dá)，G0/G1細(xì)胞周期的阻滯，TRPC1基因沉默的情況下，10個基因表達(dá)變化2倍以上，提示這些基因參與了TRPC1對aNSCs增殖的影響；
　　 (8)Orail或STIM1參與了TRPC1介導(dǎo)的鈣離子內(nèi)流，敲除Orail或STIM1后減少TG介導(dǎo)的Ba2+內(nèi)流和aNSCs的增殖；
　　 (9)轉(zhuǎn)入TRP

7、C1基因可以恢復(fù)GC處理神經(jīng)干細(xì)胞后引起的SOCE減少；
　　 (10)TRPC1干擾抑制p-Akt、p-CREB的表達(dá)，GC抑制Akt和CREB的表達(dá)。
　　 結(jié)論：
　　 (1)GC抑制成年神經(jīng)干細(xì)胞的增殖；TRPC1在成年海馬SGZ區(qū)的表達(dá)；
　　 (2)GC抑制TRPC1的基因表達(dá)，說明TRPC1參與了GC抑制成年神經(jīng)干細(xì)胞的增殖過程；
　　 (3)SOCE存在于增殖的aNSCs，抑制TR

8、PC1表達(dá)，神經(jīng)干細(xì)胞在G0/G1期阻滯，TRPC1基因沉默的情況下，10個基因表達(dá)變化2倍以上，提示這些基因參與了TRPC1對aNSCs增殖的影響；
　　 (4)Orail或STIM1參與了TRPC1介導(dǎo)的鈣離子內(nèi)流，敲除Orail或STIM1后減少TG介導(dǎo)的Ba2+內(nèi)流，抑制aNSCs的增殖；
　　 (5)GC處理成年神經(jīng)干細(xì)胞，TRPCI介導(dǎo)的外鈣內(nèi)流進(jìn)一步減少，轉(zhuǎn)入TRPC1基因可以恢復(fù)GC處理神經(jīng)干細(xì)胞后引起的