RNAi抑制HIF-1α的表達(dá)對(duì)MCF-7細(xì)胞MTX藥物敏感性和裸鼠體內(nèi)成瘤性的影響及對(duì)hADAS細(xì)胞體外向內(nèi)皮細(xì)胞分化影響的初步研究.pdf

1、第一部分RNA干擾抑制缺氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)的表達(dá)對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞MTX藥物敏感性和裸鼠體內(nèi)成瘤性的影響 研究目的:以MCF-7細(xì)胞為模型探討缺氧誘導(dǎo)因子(HIF-1)在乳腺腫瘤生長(zhǎng)中的作用；探討以HIF-1α為分子靶點(diǎn)，治療乳腺腫瘤的可能性。 研究方法: 1.應(yīng)用商品化的shRNA表達(dá)載體pSilencer2.1-U6hygro，在MCF-7細(xì)胞中抑制HIF-1α的表達(dá)； 2.應(yīng)用Rea

2、ltimeRT-PCR技術(shù)，研究缺氧(1％O2分壓)條件下，抑制HIF-1α的表達(dá)對(duì)其靶基因如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、磷酸甘油酸激酶(PGK)、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(Glut-1)和P-糖蛋白(P-pg)表達(dá)的影響； 3.應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)研究抑制HIF-1α的表達(dá)對(duì)細(xì)胞周期分布的影響； 4.應(yīng)用MTT比色法研究抑制HIF-1α的表達(dá)對(duì)化療藥物甲氨喋呤(MTX)敏感性的影響； 5.將細(xì)胞接種于裸鼠皮下和乳腺脂肪墊處

3、，通過(guò)動(dòng)物模型來(lái)探討抑制HIF-1α的表達(dá)對(duì)異種移植瘤生長(zhǎng)的影響。 研究結(jié)果:與對(duì)照組相比，干擾HIF-1α的表達(dá)，明顯下調(diào)缺氧條件下VEGF、PGK、Glut-1、P-gp等靶基因的表達(dá)，減弱缺氧對(duì)細(xì)胞周期的抑制，增加細(xì)胞對(duì)化療藥物MTX的敏感性。裸鼠皮下和同位移植瘤實(shí)驗(yàn)均表明，抑制HIF-1α的表達(dá)，能夠明顯抑制腫瘤的生長(zhǎng)，其機(jī)制可能是通過(guò)抑制腫瘤的血管新生和糖代謝過(guò)程來(lái)發(fā)揮作用。 結(jié)論: 1.HIF-1α是

4、乳腺腫瘤治療潛在的分子靶點(diǎn)，抗HIF-1策略與傳統(tǒng)的化療相結(jié)合可能會(huì)得到更好的效果； 2.RNA干擾是一種研究基因功能，發(fā)現(xiàn)及確定腫瘤治療分子靶的有力工具。 第二部分RNA干擾抑制HIF-1α的表達(dá)對(duì)人脂肪源成體干細(xì)胞體外向內(nèi)皮細(xì)胞分化影響的初步研究 研究目的: 1.構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，在原代培養(yǎng)的人脂肪源成體干細(xì)胞(ADAScells)上介導(dǎo)高效、特異的RNAi。 2.研究抑制缺氧誘導(dǎo)因子1α(

5、HIF-1α)的表達(dá)，對(duì)ADAS細(xì)胞體外向內(nèi)皮細(xì)胞分化的影響。 研究方法: 1.把可以在細(xì)胞中驅(qū)動(dòng)表達(dá)短發(fā)夾RNA(shRNA)的U6啟動(dòng)子表達(dá)框和增強(qiáng)綠色熒光蛋白(eGFP)基因克隆到逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pMSCVneo中，構(gòu)建以逆轉(zhuǎn)錄病毒為骨架的RNA干擾載體pMSCVneo/eGFP-U6； 2.RealtimeRT-PCR和westernblot實(shí)驗(yàn)分別在mRNA和蛋白水平上證實(shí)，利用pMSCVneo/eGFP

6、-U6載體在ADAS細(xì)胞中高效、特異地抑制HIF-1α的表達(dá)； 3.流式細(xì)胞儀研究抑制HIF-1α的表達(dá)對(duì)ADAS細(xì)胞免疫表型和細(xì)胞周期的影響； 4.體外將ADAS細(xì)胞向成骨和脂肪方向誘導(dǎo)，觀察抑制HIF-1α的表達(dá)對(duì)其分化能力的影響； 5.體外誘導(dǎo)ADAS細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞分化，觀察抑制HIF-1α的表達(dá)對(duì)其分化的影響。 研究結(jié)果: 1.利用重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pMSCVneo/eGFP-U6可以在人