中性粒細(xì)胞彈力酶對(duì)呼吸道黏蛋白5AC基因表達(dá)及其轉(zhuǎn)錄調(diào)控的影響.pdf

1、目的：黏液高分泌和中性粒細(xì)胞聚集是氣道慢性炎癥性疾病的重要病理特征，前者導(dǎo)致黏液潴留從而引起并加重病變氣道的阻塞，同時(shí)為細(xì)菌定植氣道提供良好的培養(yǎng)基；而后者可釋放多種促分泌因子加劇前述過程。目前認(rèn)為具有組織溶解性的中性粒細(xì)胞彈力酶(neutrophilelastase，NE)可強(qiáng)烈誘導(dǎo)黏液主要組成成分黏蛋白(MIJC)表達(dá)增加，而MUC5AC作為炎癥氣道粘蛋白的主要特征性表型，決定著高分泌黏液的病理特性。研究發(fā)現(xiàn)MUC5AC的異常表達(dá)可

2、被多種體內(nèi)的炎癥介質(zhì)和細(xì)胞外因素等所誘導(dǎo)，而各種因素誘發(fā)MUC5AC表達(dá)增加的機(jī)制最終被定位在MUC5AC基因的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)導(dǎo)致MUC5AC蛋白的合成增加。近年來，有關(guān)MUC5AC基因表達(dá)機(jī)制的研究已經(jīng)開展，但其確切機(jī)制尚未闡明。本研究通過探討NE對(duì)人氣道上皮細(xì)胞來源的肺腺癌細(xì)胞株A549細(xì)胞MUC5AC產(chǎn)生和mRNA表達(dá)的影響，以及MUC5AC基因5’上游序列的調(diào)控元件在該基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的作用，從而進(jìn)一步闡明NE在氣道慢性炎癥性疾病黏液高

3、分泌中的分子機(jī)制，并為能從基因和分子水平尋找有效的防治措施提供實(shí)驗(yàn)資料。 方法：MUC5AC在A549細(xì)胞中的表達(dá)：體外培養(yǎng)A549細(xì)胞，加入不同濃度NE作用不同時(shí)間。采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)在蛋白質(zhì)水平檢測培養(yǎng)上清液中MIC5AC蛋白含量；以RT-PCR的方法半定量測定A549細(xì)胞MIC5AC mRNA表達(dá)水平。 設(shè)計(jì)、構(gòu)建MUC5AC基因5，上游序列系列截短的熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)質(zhì)粒：根據(jù)MUC5AC基因5’

4、調(diào)控區(qū)的DNA序列及表達(dá)載體pGL3質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及實(shí)驗(yàn)需要設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物。從人的基因組總DNA分離出MUC5AC基因5’非編碼區(qū)大小為1300bp的啟動(dòng)子片段，并以此為模板對(duì)其進(jìn)行5’端刪除分析。MUC5AC基因5’上游序列系列截短的熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)酶切和DNA測序鑒定證實(shí)構(gòu)建成功后，用脂質(zhì)體將報(bào)告基因質(zhì)粒和內(nèi)參照質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，連續(xù)培養(yǎng)24h后加NE(濃度為100 nM)處理，孵育24h收集細(xì)胞，采用雙熒光素酶

5、報(bào)告基因檢測系統(tǒng)測定報(bào)告基因的表達(dá)水平。 運(yùn)用序列分析法和聚合酶鏈反應(yīng)對(duì)構(gòu)建質(zhì)粒上的兩個(gè)順式調(diào)控元件分別進(jìn)行定點(diǎn)突變：應(yīng)用序列分析法確定據(jù)轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)約80bp和220bp分別含有順式作用元件SP-1序列GGCCCCGCCC和NF-кB序列GGGGAGGACCCCT，設(shè)計(jì)兩對(duì)導(dǎo)入定點(diǎn)突變引物，采用定點(diǎn)突變技術(shù)分別構(gòu)建Sp-1及NF-кB位點(diǎn)的單獨(dú)突變體，含人MUC5AC基因順式調(diào)控元件定點(diǎn)突變序列熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒經(jīng)酶切和DNA

6、測序鑒定證實(shí)構(gòu)建成功后，用脂質(zhì)體將報(bào)告基因質(zhì)粒和內(nèi)參照質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，連續(xù)培養(yǎng)24h后加NE(濃度為100 nM)處理，孵育24小時(shí)收集細(xì)胞，采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測系統(tǒng)測定報(bào)告基因的表達(dá)水平。 結(jié)果： 1、用ELISA法檢測A549細(xì)胞培養(yǎng)上清液中MUC5AC蛋白的表達(dá)，10、50、100nMNE處理A549細(xì)胞5、10、30min，相同時(shí)間點(diǎn)不同濃度NE組MUC5AC蛋白表達(dá)水平分別與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)

7、學(xué)意義(t=3.406～20.909，P均<0.05)，且呈時(shí)間、劑量依賴的趨勢(P<0.01)。用RT-PCR的方法檢測MUC5AC mRNA表達(dá)，100 nM NE處理30min后A549細(xì)胞MUC5ACmRNA相對(duì)表達(dá)量明顯高于對(duì)照組(t=10.299，P<0.01)。 2、成功構(gòu)建了4種含有MUC5AC基因啟動(dòng)子序列系列截短的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒，用真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)分別將四種含人MUC5AC基因啟動(dòng)子序列系列截短的報(bào)告基

8、因質(zhì)粒導(dǎo)入A549細(xì)胞，然后用NE刺激轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞，觀察到NE可分別誘導(dǎo)含有啟動(dòng)子序列-1330bp(PGL3E-1330/+48)(P<0.05)， -689bp(PGL3E-689/+48)(P<0.05)，-324bp(pG13E-324/+48)(P<0.05)的熒光素酶基因表達(dá)，而NE不能誘導(dǎo)pGL3E-MUC5AC-64/+48表達(dá)熒光素酶活性(P>0.05)。 3、MUC5AC基因啟動(dòng)子中的順式作用元件下游N

9、F-кB結(jié)合位點(diǎn)和SP-1結(jié)合位點(diǎn)分別位于-220bp和-80bp附近。將兩種分別含有NF-кB結(jié)合位點(diǎn)和SP-1結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生定點(diǎn)突變序列的報(bào)告基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞并用NE誘導(dǎo)，觀察到NE可促使含有MUC5AC啟動(dòng)子中NF-кB結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生定點(diǎn)突變序列的報(bào)告基因質(zhì)粒表達(dá)熒光素酶，而含有SP-1結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生定點(diǎn)突變序列的報(bào)告基因質(zhì)粒對(duì)NE誘導(dǎo)無明顯反應(yīng)。 結(jié)論： 1、NE可誘導(dǎo)A549細(xì)胞MUC5AC產(chǎn)生及其mRNA表

10、達(dá)，且呈時(shí)間和劑量依賴的趨勢，表明NE在基因轉(zhuǎn)錄水平誘導(dǎo)MUC5AC表達(dá)。 2、成功地構(gòu)建了四種含人MUC5AC基因系列截短的啟動(dòng)子序列和兩種含順式作用元件發(fā)生定點(diǎn)突變序列的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒，為研究NE及其他因素誘導(dǎo)MUC5AC基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。 3、NE可分別誘導(dǎo)含有MUC5AC啟動(dòng)子-1330/+48、-689/+48、-324/+48序列的報(bào)告基因質(zhì)粒表達(dá)熒光素酶，而含有-64/+48序列的報(bào)告