氣道剪應(yīng)力作用下黏蛋白5AC胞外極向分泌的主要介導(dǎo)機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　探討氣道剪應(yīng)力(SS)作用下黏蛋白(MUC)5AC胞外極向分泌的主要介導(dǎo)機(jī)制。
　　方法:
　　(1)采用Cortactin-siRNA-pSilencer3.1-H1/neo表達(dá)載體轉(zhuǎn)染Cortactin-siRNA抑制Cortactin功能，并用Western印跡法檢測(cè)目標(biāo)序列組與對(duì)照序列組的Cortactin水平，確認(rèn)轉(zhuǎn)染成功后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　(2)采用節(jié)律性旋轉(zhuǎn)裝置模擬呼吸時(shí)氣流介導(dǎo)的SS

2、。該裝置旋轉(zhuǎn)過(guò)程中通過(guò)加速/減速交替進(jìn)行的方式模擬呼吸過(guò)程中吸氣/呼氣對(duì)氣道的牽拉作用即為剪應(yīng)力。為模擬病理狀態(tài)下氣流對(duì)氣道上皮細(xì)胞的SS作用，我們把加速/減速的時(shí)間設(shè)置為1.2s/次，30次/min。每組作用30min。
　　(3)人支氣管上皮細(xì)胞(16HBE)以5×105個(gè)細(xì)胞/孔接種在6孔硅膠培養(yǎng)皿上并置于37℃、5％ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合至70％左右，使用Stata軟件產(chǎn)生隨機(jī)數(shù)組隨機(jī)分為5組:A組（空白對(duì)照

3、組）;B組(SS組);C組(SS+Rac-1特異性抑制劑組);D組(SS+F-actin解聚劑組);E組（SS+Coaactin-siRNA轉(zhuǎn)染組）;每組各設(shè)6個(gè)復(fù)孔。置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2h后進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次用于統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　(4)分別采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中MUC5AC的胞外相對(duì)分泌量;Western印跡法檢測(cè)Cortactin及p-Cortactin的相對(duì)水平和

4、轉(zhuǎn)染效果;激光共聚焦顯微鏡觀察F-actin聚合情況。
　　結(jié)果:
　　(1)通過(guò)Western印跡法檢測(cè)目標(biāo)序列組與對(duì)照序列組的Cortactin相對(duì)表達(dá)水平后確認(rèn)Cortactin-siRNA-pSilencer3.1-H1/neo表達(dá)載體轉(zhuǎn)染成功，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　(2) ELISA法檢測(cè)各組細(xì)胞上清液中MUC5AC水平:與A組（0.210±0.013）相比，B組（0.631±0.025）MUC5AC胞外相對(duì)

5、分泌水平顯著增加(P=0.000);與B組相比，C組、D組和E組（0.473±0.112、0.330±0.067、0.272±0.019）MUC5AC胞外相對(duì)分泌水平均明顯降低(P=0.043、0.000、0.000)。
　　(3) Western印跡法檢測(cè)Cortactin及p-Cortactin的相對(duì)水平:B組Cortactin相對(duì)表達(dá)水平為（0.670±0.048），顯著高于E組的（0.132±0.014）(P＜0.01)，

6、但與A、C、D組的（0.641±0.016、0.622±0.012、0.653±0.027）比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）;B組p-Cortactin相對(duì)表達(dá)水平為(0.582±0.067)，顯著高于A、C、E組的（0.131±0.011、0.393±0.045、0.170±0.016）(P=0.000、0.021、0.000)，而D組（0.511±0.029）與B組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.246)。
　　(4)激光共

7、聚焦顯微鏡觀察F-actin聚合情況:A組幾乎沒(méi)有聚合狀態(tài)的F-actin，表現(xiàn)為無(wú)絲狀熒光出現(xiàn);B組F-actin聚合程度高，呈平行排列、粗細(xì)均勻、長(zhǎng)短一致的絲狀熒光;C組F-actin聚合程度較B組略有減弱，絲狀熒光的平行排列稍顯紊亂、粗細(xì)稍欠均勻、長(zhǎng)短不一致;D組F-actin聚合程度顯著降低，絲狀熒光排列紊亂，無(wú)細(xì)長(zhǎng)的絲狀熒光;E組F-actin聚合程度明顯降低，絲狀熒光長(zhǎng)短不一、粗細(xì)不均、排列紊亂。
　　結(jié)論: