維生素D-抗菌肽通路在肝硬化并發(fā)自發(fā)性細菌性腹膜炎發(fā)病及治療中的作用.pdf

1、目的：
　　 通過檢測慢性肝病不同階段患者的血清25羥基維生素D(25.hydroxyvitaminD,25OHD)水平,了解這類患者的維生素D狀態(tài),并探討維生素D水平與肝臟疾病嚴重程度的關(guān)系;通過檢測肝硬化腹水患者腹腔白細胞維生素D受體(vitaminDreceptor,VDR)及LL-37(人抗菌肽)的表達水平,探討是否維生素D-抗菌肽通路參與自發(fā)性細菌性腹膜炎(spontaneousbacterialperitonitis

2、,SBP)的發(fā)病機制:通過檢測腹腔巨噬細胞經(jīng)維生素D干預前后其VDR及LL-37水平變化情況,明確維生素D對腹腔巨噬細胞LL-37應答的調(diào)控,探討維生素D是否可增強腹腔局部的抗菌免疫功能。
　　 材料與方法：
　　 一、實驗材料:
　　 1、研究對象:
　　 選擇2011年4月至2011年12月期間于中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院第二感染性疾病、肝病病房住院治療的183例慢性肝炎或肝硬化患者為研究對象。所有患者

3、均行肝臟生化學、免疫學、病毒學及腎功能、凝血機制檢測,肝硬化腹水患者入院后行診斷性腹腔穿刺術(shù)檢測,行肝臟影像學檢查,并記錄病例人口學及病因?qū)W特點。
　　 慢性乙型肝炎診斷標準參照《慢性乙型肝炎防治指南》、慢性丙型肝炎診斷標準參照《丙型肝炎防治指南》、肝硬化診斷標準參考《病毒性肝炎防治方案》、SBP診斷標準參照美國肝病研究協(xié)會制定的指南。
　　 排除標準:6個月內(nèi)曾補充過維生素D治療的全部慢性肝病患者;SBP發(fā)生前1個月內(nèi)

4、應用過口服選擇性腸道殺菌劑諾氟沙星或其他抗生素、或腹腔穿刺術(shù)前2周內(nèi)應用抗生素治療的肝硬化腹水患者。
　　 2、主要試劑:
　　 1,2,5(OH)2D3、LPS(055:B5)(Sigma,St.Louis,MO,USA)
　　 RNAisoPlusTMRNA提取試劑盒、PrimeSciptTM逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR(R)PremixExTaqTM實時定量PCR試劑盒(寶生物工程有限公司,大連,中國)
　

5、　 VDRcDNA引物序列F:5'-GACCTGGTCAGTTACAGCATCCAA-3'R:5'-TCAGCAGTACGATCTGGTCCTCA-3'
　　 LL-37cDNA引物序列F:5'-GACACGCCAAAGCCTGTGAG-3'R:5'-LTCACCCAGCAGGGCAAATC-3'GAPDHcDNA引物序列F:5‘-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'R:5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-

6、3'
　　 兔抗人LL-37抗體、小鼠抗人VDR抗體、小鼠抗人β-Actin抗體(SantaCruz,SantaCruz,CA,USA)
　　 HRP標記山羊抗兔IgG、HRP標記山羊抗小鼠IgG、FITC標記山羊抗兔IgG、羅丹明標記山羊抗小鼠IgG(中杉金橋生物技術(shù)有限公司,北京,中國)
　　 PE標記小鼠抗人CD11b抗體、FITC標記小鼠抗人CDl4抗體(四正柏生物科技有限公司,北京,中國)
　　

7、 25-羥基維生素D檢測試劑盒(IDS,FountainHills,AZ,USA)
　　 人LL-37ELISA檢測試劑盒(HyCult,Uden,Netherlands)
　　 二、實驗方法:
　　 1、慢性肝病嚴重程度判斷:
　　 慢性肝炎病變程度判斷:參考《病毒性肝炎防治方案》,將慢性肝炎病例分為輕度、中度和重度。
　　 肝硬化肝臟損害嚴重程度評估:參考Child-Pugh評分標準,肝硬化患

8、者分為Child-PughA級、B級和C級;同時進行終術(shù)期肝病疾病模型(modelofend-stageliverdisease,MELD)評分。
　　 2、維生素D狀態(tài)參考標準:
　　 根據(jù)慢性肝病患者血清25OHD濃度,將其劃分為維生素D充足、缺乏和不足。
　　 3、血清及腹水上清250HD濃度測定:
　　 ELISA方法。
　　 4、腹腔白細胞收集:
　　 離心腹水,收集下層白細胞團

9、塊。
　　 5、腹腔巨噬細胞分離純化及純度鑒定:
　　 將腹腔白細胞貼壁培養(yǎng)2小時,去除未貼壁細胞,剩余細胞為腹腔巨噬細胞。并經(jīng)流式細胞儀檢驗CD11b+CD14+雙陽性細胞為巨噬細胞。
　　 6、腹腔巨噬細胞培養(yǎng)及藥物干預:
　　 將腹腔巨噬細胞于含5%胎牛血清的無酚紅DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng),分別給予不同濃度LPS、1,25(OH)2D3,并孵育不同時間,選擇藥物最適作用濃度及作用時間;將巨噬細胞與LPS

10、及1,25(OH)2D3共同孵育,檢測1,25(OH)2D3對腹腔巨噬細胞抗菌肽應答的調(diào)控。
　　 7、巨噬細胞VDR及LL-37的表達:
　　 應用real-timePCR方法檢測VDR及LL-37mRNA表達;應用westernblot方法檢測VDR蛋白表達,應用ELISA方法檢測培養(yǎng)液上清LL-37濃度;應用免疫熒光方法檢測VDR及LL-37蛋白表達。
　　 結(jié)果：
　　 1、慢性肝病患者維生素D水

11、平的研究:
　　 維生素D缺乏或不足存在于98.3%的慢性肝病患者中。在全部肝硬化患者中,第三季度取材的患者血清25OHD水平高于第二及第四季度(P=0.019)。對第二季度119例慢性肝臟疾病患者的分析發(fā)現(xiàn),慢性肝炎患者的血清25OHD水平顯著高于肝硬化患者(P=0.001);隨著肝硬化患者Child-Pugh分級的升高,血清25OHD水平逐漸下降(P=0.004)。相關(guān)分析發(fā)現(xiàn),血清25OHD水平與反映肝臟合成及代謝功能的指

12、標存在相關(guān)性(P＜0.05)。維生素D缺乏的危險因素包括:肝硬化(慢性肝炎/肝硬化)、及血清總膽紅素(totalbilirubin,TBIL)水平高(P＜0.05)。
　　 2、肝硬化并發(fā)自發(fā)性細菌性腹膜炎患者腹腔白細胞抗菌肽及其調(diào)控分子的表達:
　　 肝硬化腹水患者也存在與肝臟疾病嚴重程度相關(guān)的維生素D水平低下狀態(tài),而且他們的腹水25OHD水平也普遍偏低,且與血清25OHD水平呈正相關(guān)(r=0.74,P＜0.001)。

13、肝硬化并發(fā)SBP患者的腹腔白細胞VDRmRNA1及LL-37mRNA2的表達均高于單純腹水患者(P1=0.005,P2=0.003);在并發(fā)SBP患者中,兩者存在正相關(guān)(r=0.70,P=0.001)。
　　 3、維生素D對肝硬化腹水患者腹腔巨噬細胞抗菌肽表達的干預研究:
　　 維生素D單獨孵育可顯著上調(diào)腹腔巨噬細胞LL-37mRNA的表達,而且維生素D濃度越大,上調(diào)作用越顯著(P=0.004);表達的高峰時間為孵育36

14、小時(P＜0.001)。在維生素D缺乏的條件下,LPS可抑制腹腔巨噬細胞VDRmRNA1及LL-37mRNA2的表達(P1=0.007,P2＜0.001);而維生素D可逆轉(zhuǎn)這種抑制作用,而且對LL-37表達水平的逆轉(zhuǎn)隨著維生素D濃度的升高而增強(P＜0.001);相比于LPS孵育,兩者共同孵育可上調(diào)VDR1及LL-372的表達(P1＜0.001,P2=0.026)。
　　 結(jié)論：
　　 維生素D缺乏在慢性肝病患者,特別是