SOCS3基因下調(diào)對追趕生長IUGR大鼠肝細胞糖代謝調(diào)控及胰島素抵抗機制研究.pdf

1、本文內(nèi)容分為三部分：
　　第一部分原代大鼠肝細胞分離及培養(yǎng)鑒定
　　目的：建立一種相對簡易的原代大鼠肝細胞分離及培養(yǎng)方法,并對肝細胞純度及生物活性進行鑒定。
　　方法：原代大鼠肝細胞經(jīng)改良原位非循環(huán)兩步灌流法及多次過濾低速離心法分離后,再用常規(guī) DMEM高糖培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng);采用錐蟲藍拒染法檢測接種瞬時肝細胞的存活率,在倒置顯微鏡下觀察肝細胞形態(tài)變化。通過過碘酸-Schiff反應(yīng)(PAS)來檢測肝細胞糖原合成及儲備能力;

2、利用免疫細胞化學法檢測肝細胞角蛋白18(CK-18)的表達;聯(lián)合兩者判斷肝細胞純度。
　　結(jié)果：每只 SD大鼠可以獲1.38*108～1.74*108個肝細胞,肝細胞活性在接種瞬時大于90％。倒置顯微鏡下可觀察到接種后4h肝細胞基本貼壁,貼壁后肝細胞胞體變平變大,隨后鄰近的肝細胞相互靠攏形成島狀或條索狀結(jié)構(gòu)。肝細胞內(nèi)糖原經(jīng) PAS染色后被染成紅色顆粒狀或者片狀。CK-18經(jīng)抗 CK-18免疫細胞化學染色后呈棕黃色均勻分布于肝細胞內(nèi)

3、。通過 PAS染色及抗 CK-18免疫細胞化學染色后聯(lián)合鑒定肝細胞純度在95％左右。
　　結(jié)論：通過改良原位兩步非循環(huán)灌注法及多次過濾低速離心法成功分離并培養(yǎng)原代大鼠肝細胞,該方法相對容易操作,所培養(yǎng)肝細胞數(shù)量、活力和純度較高,可在具備普通細胞培養(yǎng)條件的實驗室推廣應(yīng)用。
　　第二部分追趕生長 IUGR大鼠肝細胞 SOCS3和胰島素受體后轉(zhuǎn)導通路分子表達變化
　　目的：研究追趕生長宮內(nèi)發(fā)育遲緩(CG-IUGR)大鼠肝細胞

4、中細胞因子信號轉(zhuǎn)導抑制因子3(SOCS3)和胰島素受體后信號轉(zhuǎn)導途徑中關(guān)鍵分子胰島素受體底物1(IRS1)、胰島素受體底物2(IRS2)、磷脂酰肌醇(-3)激酶(PI3K)、蛋白激酶 Akt2以及糖異生途徑關(guān)鍵酶磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK)和葡萄糖-6-磷酸酶(G6Pase)的表達變化,初步探討追趕生長 IUGR大鼠胰島素抵抗的發(fā)生機制。
　　方法：采用孕期全程限食以及縮減每窩仔鼠數(shù)量的方法建立 CG-IUGR大鼠模型;評價

5、追趕生長宮內(nèi)發(fā)育遲緩大鼠糖脂代謝狀態(tài);運用改良原位兩步非循環(huán)灌流法分離并培養(yǎng)原代大鼠肝細胞;采用實時定量 PCR(RT-PCR)和Western blot檢測胰島素抵抗 CG-IUGR大鼠肝細胞于基礎(chǔ)狀態(tài)和胰島素刺激狀態(tài)下 SOCS3、IRS1、IRS2和PI3K在 mRNA和蛋白水平表達變化并評估胰島素刺激前后 Akt2磷酸化水平以及糖異生關(guān)鍵酶在轉(zhuǎn)錄水平的表達變化。
　　結(jié)果：CG-IUGR大鼠肝細胞在基礎(chǔ)狀態(tài)和胰島素刺激狀態(tài)

6、下,SOCS3在 mRNA和蛋白水平表達量均較正常對照組高(P<0.05);IRS1和PI3K在 mRNA和蛋白水平表達量均較正常對照組低(P<0.05),而IRS2在 mRNA和蛋白水平表達量與正常對照組相比無明顯差異(P>0.05);磷酸化 Akt2表達水平均較正常對照組降低。胰島素刺激后對PEPCK和G6Pase轉(zhuǎn)錄水平的抑制作用在 CG-IUGR大鼠肝細胞較正常大鼠細胞降低。
　　結(jié)論：CG-IUGR大鼠肝細胞中SOCS3

7、表達量增加,通過負性調(diào)節(jié)下調(diào) IRS1的表達且下游的分子活化水平隨之降低;CG-IUGR肝細胞糖異生關(guān)鍵酶轉(zhuǎn)錄水平增高意味著胰島素敏感性降低且肝糖生成增多,這可能是 CG-IUGR大鼠發(fā)生以胰島素抵抗為核心的疾病分子機制之一。
　　第三部分 SOCS3表達下調(diào)對追趕生長 IUGR肝細胞胰島素受體后信號轉(zhuǎn)導及糖代謝的影響
　　目的：探討轉(zhuǎn)錄水平下調(diào) SOCS3表達對追趕生長宮內(nèi)發(fā)育遲緩大鼠(CG-IUGR)胰島素受體后信號轉(zhuǎn)導

8、通路關(guān)鍵分子表達變化以及葡糖糖代謝的影響。
　　方法：運用孕期全程限食以及縮減每窩仔鼠數(shù)量的方法建立追趕生長宮內(nèi)發(fā)育遲緩大鼠模型;大鼠肝細胞采用改良原位兩步非循環(huán)灌流法分離并培養(yǎng);以脂質(zhì)體為載體將針對大鼠SOCS3基因設(shè)計的特異性 siRNA分子(siSOCS3)轉(zhuǎn)染至 CG-IUGR大鼠肝細胞中,采用實時定量 PCR(RT-PCR)和Western blot篩選出最有效干擾分子;干擾后48h,檢測 CG-IUGR大鼠肝細胞于基礎(chǔ)

9、狀態(tài)和胰島素刺激狀態(tài)下 IRS1、PI3K蛋白水平和Akt2磷酸化水平表達變化并用RT-PCR評估干擾后對糖異生關(guān)鍵酶轉(zhuǎn)錄水平表達的影響。
　　結(jié)果：干擾后48h,CG-IUGR大鼠肝細胞在基礎(chǔ)狀態(tài)和胰島素刺激狀態(tài)下,IRS1和PI3K蛋白水平表達量均較干擾前高(P<0.05);磷酸化 Akt2表達水平均較干擾前增高。基礎(chǔ)狀態(tài)下,CG-IUGR大鼠肝細胞 PEPCK和G6Pase轉(zhuǎn)錄水平于干擾后較干擾前降低,但差異不具有統(tǒng)計學意義