穿山龍總皂苷對(duì)CIA大鼠關(guān)節(jié)滑膜血管新生相關(guān)因子及其受體的影響.pdf

1、目的:
　　 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是常見、多發(fā)的自身免疫性疾病,病變主要侵犯關(guān)節(jié)滑膜,表現(xiàn)為多發(fā)性、進(jìn)行性的滑膜炎,病理特征為滑膜細(xì)胞增生、血管新生增多、血管翳形成等。近年研究表明血管新生和血管翳的形成在RA的發(fā)生發(fā)展中具有非常重要的作用,抑制血管新生可能是治療RA的一個(gè)新靶點(diǎn)。前期研究已經(jīng)表明穿山龍總皂苷灌胃給藥可以緩解大鼠關(guān)節(jié)腫脹等炎癥反應(yīng),減輕滑膜炎性細(xì)胞浸潤和滑膜組織增生等病理改

2、變；可以抑制IL-1β、IL-6、TNF—α等炎性細(xì)胞因子。本研究目的是在前期工作的基礎(chǔ)上,以膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(collagen-inducedarthritis,CIA)大鼠為模型,探討穿山龍總皂苷對(duì)血管新生相關(guān)因子血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)及其受體Flk-1,血管生成素2(angiopoietin-2,Ang-2)及其受體Tie-2等的影響,為進(jìn)一步闡明穿山龍治

3、療RA的作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù),為使其開發(fā)成一種新的治療RA制劑奠定基礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 1清潔級(jí)雌性Wistar大鼠65只,隨機(jī)分為5組:正常對(duì)照組、CIA模型組、穿山龍總皂苷組(25mg／kg／d)、雷公藤對(duì)照組(12mg／kg／d)和薯蕷皂苷元組(50mg／kg／d,25mg／kg／d),每組12只。除正常組外,其余組大鼠均建立CIA大鼠模型,待于模型成功建立后,分別給予相應(yīng)的藥物灌胃21d,正常對(duì)照組、CIA

4、模型組灌服等體積溶媒(0.5％CMC)。
　　 1.1取血后處死大鼠,各組分別取膝關(guān)節(jié)滑膜(薯蕷皂苷元組取用藥劑量為50mg／kg／d的大鼠)采用免疫組織化學(xué)染色觀察滑膜微血管密度(micro-vessel density,MVD),和VEGF、Flk-1、Ang-2及Tie-2的表達(dá)水平。采用MiVnt圖像分析系統(tǒng)對(duì)結(jié)果進(jìn)行定量分析。
　　 1.2取血后處死大鼠,各組分別取膝關(guān)節(jié)滑膜(薯蕷皂苷元組取用藥劑量為25mg／

5、kg／d的大鼠),Trizol提取滑膜總RNA,逆轉(zhuǎn)錄cDNA,采用PrimeScripTM實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒檢測(cè)各組滑膜組織VEGFmRNA的表達(dá)水平。
　　 2采用SPSS11.5軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示,組間比較用單因素方差分析,組間兩兩比較用q檢驗(yàn),以α=0.01作為顯著性檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。
　　 結(jié)果:
　　 1一般狀態(tài)
　　 大鼠初次免疫注射后,背部及尾根部形

6、成多處小潰瘍,第12d后,后足部出現(xiàn)明顯腫脹,發(fā)紅；以后逐漸累及后肢膝關(guān)節(jié)及前肢。CIA模型組大鼠進(jìn)食減少,精神萎靡,四肢關(guān)節(jié)持續(xù)腫脹,隨著病情發(fā)展足爪出現(xiàn)畸形,行動(dòng)不便。經(jīng)相應(yīng)藥物治療后,穿山龍總皂苷組、雷公藤對(duì)照組、薯蕷皂苷元組大鼠與CIA模型組大鼠相比,上述癥狀均有不同程度減輕。正常組大鼠在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間飲食正常,精神狀態(tài)好,被毛有光澤,四肢關(guān)節(jié)無明顯變化。
　　 2各組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜微血管密度(MVD)
　　 CI

7、A模型大鼠滑膜組織血管豐富,新生血管數(shù)量較多且密集,MVD(9.20±1.30)條明顯大于空白對(duì)照組(3.00±0.71)條(P<0.01)。與CIA組大鼠相比,穿山龍總皂苷組、雷公藤對(duì)照組、薯蕷皂苷元組大鼠的MVD分別為(4.80±0.45、5.00±0.82、5.20±0.84)條均明顯降低(P<0.01),各治療組間比較無明顯差異(P>0.05)。
　　 3各組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜VEGF蛋白的表達(dá)
　　 VEGF免疫組

8、化陽性產(chǎn)物為黃色或棕黃色顆粒,位于細(xì)胞漿。與空白對(duì)照組相比,CIA模型組大鼠滑膜VEGF的表達(dá)明顯升高(P<0.01)。與CIA模型組相比,穿山龍總皂苷組、雷公藤對(duì)照組、薯蕷皂苷元組大鼠滑膜VEGF的表達(dá)明顯降低(P<0.01),各治療組間比較無明顯差異(P>0.05)。
　　 4各組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜Flk-1蛋白的表達(dá)
　　 Flk-1免疫組化陽性產(chǎn)物為黃色或棕黃色顆粒,位于細(xì)胞漿或細(xì)胞膜。與空白對(duì)照組相比,CIA模型組

9、大鼠滑膜Flk-1的表達(dá)明顯升高(P<0.01)。與CIA模型組相比,穿山龍總皂苷組、雷公藤對(duì)照組、薯蕷皂苷元組大鼠滑膜Flk-1的表達(dá)明顯降低(P<0.01),各治療組間比較無明顯差異(P>0.05)。
　　 5各組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜Ang-2蛋白的表達(dá)
　　 Ang-2免疫組化陽性產(chǎn)物為黃色或棕黃色顆粒,位于細(xì)胞漿,少量表達(dá)于細(xì)胞核。與空白對(duì)照組相比,CIA模型組大鼠滑膜Ang-2的表達(dá)明顯升高(P<0.01)。與CIA

10、模型組相比,穿山龍總皂苷組、雷公藤對(duì)照組、薯蕷皂苷元組大鼠滑膜Ang-2的表達(dá)明顯降低(P<0.01),各治療組間比較無明顯差異(P>0.05)。
　　 6各組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜Tie-2蛋白的表達(dá)
　　 Tie-2免疫組化陽性產(chǎn)物為黃色或棕黃色顆粒,位于細(xì)胞漿或細(xì)胞膜。與空白對(duì)照組相比,CIA模型組大鼠滑膜Tie-2的表達(dá)明顯升高(P<0.01)。與CIA模型組相比,穿山龍總皂苷組、雷公藤對(duì)照組、薯蕷皂苷元組大鼠關(guān)節(jié)滑膜T

11、ie-2的表達(dá)呈降低趨勢(shì),但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),各治療組間比較無明顯差異(P>0.05)。
　　 7實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜VEGFmRNA的表達(dá)水平
　　 與空白對(duì)照組VEGF目的基因表達(dá)量(0.736±0.162)比較,CIA模型組VEGF目的基因表達(dá)量(1.056±0.342)明顯升高(P<0.01)；與CIA模型組比較,穿山龍總皂苷組VEGF目的基因表達(dá)量(0.433±0.233)、雷公

12、藤對(duì)照組VEGF目的基因表達(dá)量(0.711±0.160)和薯蕷皂苷元組VEGF目的基因表達(dá)量(0.750±0.199)明顯降低(P<0.01)；與薯蕷皂苷元組與雷公藤對(duì)照組VEGF目的基因表達(dá)量比較,穿山龍總皂苷組VEGF目的基因表達(dá)量降低(P<0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1 CIA模型大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜血管新生增多,細(xì)胞因子VEGF及其受體Flk-1、Ang-2及其受體Tie-2表達(dá)升高。
　　 2穿山龍總皂