海蛇乙醇提取物對(duì)膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜血管生成調(diào)控因子的影響.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)采用DA大鼠膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎(collagen induced arthritis，CIA)模型，從類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎滑膜新生血管生成的角度，部分揭示海蛇治療類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制，并為中醫(yī)運(yùn)用蟲(chóng)類(lèi)藥通絡(luò)治療痹證提供科學(xué)依據(jù)。 方法 1動(dòng)物分組及處理將30只雄性DA大鼠隨機(jī)分為3組：空白對(duì)照組、CIA模型組、海蛇治療組，每組10只。參照文獻(xiàn)，于實(shí)驗(yàn)開(kāi)始第一天，取適量大鼠Ⅱ型膠原，將其溶于0.1M乙酸，配成濃度為2mg/

2、ml Ⅱ型膠原溶液，此溶液再與等量完全Freund's佐劑(CFA)混合，充分乳化后，按150μgⅡ型膠原/只大鼠，于尾根部皮下注射，空白對(duì)照組以等量生理鹽水于尾根部皮下注射。造模第15d，海蛇組按1.84g/kg.d，1ml/100g體重灌胃給藥，空白對(duì)照組及模型組分別按1ml/100g體重給予生理鹽水灌胃，治療后30d乙醚麻醉下取全血；處死動(dòng)物，取膝關(guān)節(jié)用多聚甲醛固定36h后，放入10％EDTA·Na<,2>溶液脫鈣備用。

3、2指標(biāo)檢測(cè) 2.1關(guān)節(jié)炎指數(shù)(Arthritis Index，AI)的計(jì)算造模后第15d開(kāi)始觀察并記錄全身關(guān)節(jié)病變程度。根據(jù)《現(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)方法》一書(shū)中的方法，關(guān)節(jié)積分每周兩次，以判斷其大體發(fā)病率。全身病變按5級(jí)評(píng)分法評(píng)價(jià)，4只肢體的病變程度累計(jì)積分，計(jì)算出AI。0分：無(wú)紅腫；1分：小趾關(guān)節(jié)紅腫；2分：趾關(guān)節(jié)和足跖腫脹；3分：踝關(guān)節(jié)以下的足爪腫脹；4分：包括踝關(guān)節(jié)在內(nèi)的全部足爪腫脹。把各個(gè)關(guān)節(jié)的積分累計(jì)起來(lái)，即為每只大鼠的AI，每

4、個(gè)動(dòng)物最大為16分。 2.2大鼠膝關(guān)節(jié)光鏡觀察取大鼠的膝關(guān)節(jié)用多聚甲醛固定，10％EDTA·Na<,2>溶液脫鈣，酒精逐級(jí)脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片，常規(guī)HE染色。光鏡下觀察滑膜、軟骨、骨的病理改變。 2.3外周全血T細(xì)胞亞群檢測(cè)樣品測(cè)定管中各加入50μl抗凝血，然后每管中加入相應(yīng)的抗體10μl，振蕩混勻，4℃冰箱避光孵育30min，加入1ml 0.84％NH<,4>Cl溶血素，振蕩混勻，室溫避光放置5min，12

5、00r/min離心3min棄上清液，加入PBS 1ml，1200r/min離心3min棄上清液(PBS共洗滌兩次)，加入PBS400μl，混勻后上機(jī)檢測(cè)。 2.4外周血TNF-α、IFN-γ細(xì)胞因子及抗C Ⅱ抗體含量檢測(cè)外周血TNF-α、IFN-γ含量檢測(cè)，具體流程如下：一抗包被塑料板4℃過(guò)夜；將包被有特異抗體的塑料板洗1次；向凹孔內(nèi)加250μl Assay Buffer封閉，室溫(20～25℃)反應(yīng)2h；洗板2次；加50μl樣

6、品稀釋液和50μl檢測(cè)樣本(標(biāo)準(zhǔn)孔內(nèi)加入標(biāo)準(zhǔn)品)；加50μl生物素標(biāo)記的第Ⅱ抗體，室溫2h；洗板4次；加100μl鏈親合素標(biāo)記的辣根過(guò)氧化物酶，室溫1h；洗板3次；加100μl TMB，避光，室溫20～30min；加100μl終止液；讀板(450nm)。 外周血抗CⅡ抗體含量檢測(cè)，具體流程如下：用10μg/ml小牛關(guān)節(jié)軟骨CⅡ包被塑料板4℃過(guò)夜，每孔50μl，含CⅡ0.5μg；洗板1次；向凹孔內(nèi)加100μl1％BSA-PBS封閉

7、，室溫1h；洗板2次；加100μl稀釋樣品血清(標(biāo)準(zhǔn)孔內(nèi)加入標(biāo)準(zhǔn)品)，室溫2h；加50μl生物素化山羊抗大鼠抗體，室溫1h；洗板4次；加100μl鏈親合素標(biāo)記的辣根過(guò)氧化物酶，室溫30min；洗板3次；加100μl TMB，避光，室溫15min；加100μl終止液；讀板(450nm)。 2.5大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜VEGF、Flk-1、Fit-4、Ang-2、Tie-2、TNF-α、IFN-γ陽(yáng)性細(xì)胞檢測(cè)取大鼠的膝關(guān)節(jié)多聚甲醛固定，10

8、％EDTA·Na<.2>溶液脫鈣，酒精逐級(jí)脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片，進(jìn)行VEGF、Flk-1、Flt-4、Ang-2、Tie-2、TNF-α、IFN-γ的免疫組化檢測(cè)。 PV-6001染色法：脫蠟、水化組織切片；3％H<,2>O<,2>孵育10min以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性；蒸餾水沖洗，PBS浸泡5min；石蠟切片胰蛋白酶抗原修復(fù)；滴加10％正常血清封閉非特異性抗原孵育20min；傾去血清；分別加入相應(yīng)一抗體，4℃過(guò)夜

9、(以PBS代替一抗作陰性對(duì)照)；PBS沖洗5min×3次，滴加通用型IgG抗體(Fab段)-HRP多聚體，37℃孵育30min，PBS沖洗5min×3次：DAB顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹(shù)脂封片；干燥后觀察結(jié)果。每張切片隨機(jī)選取6個(gè)視野拍照，計(jì)算每個(gè)視野中陽(yáng)性表達(dá)面積的百分比值，累計(jì)相加后取平均值即為此張染色片的陽(yáng)性表達(dá)面積的百分比值。 2．6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，數(shù)據(jù)經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)確定方差齊同后采用單因素方差分析

10、，組間兩兩比較采用q檢驗(yàn)。 結(jié)果 1.大鼠AI變化：從第24d開(kāi)始CIA模型組AI明顯高于海蛇治療組，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著，且從第24d到第45d海蛇治療組AI逐漸降低。結(jié)果表明海蛇乙醇提取物治療效果明顯。 2. HE染色光鏡觀察結(jié)果：CIA組大鼠膝關(guān)節(jié)光鏡觀察可見(jiàn)滑膜細(xì)胞增生明顯，滑膜組織充血水腫，毛細(xì)血管增生，血管內(nèi)膜變形增生，管腔變窄或阻塞，血管翳形成，關(guān)節(jié)軟骨退行性變，關(guān)節(jié)面破壞，并可見(jiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn)。海蛇乙醇提取

11、物治療后增生的滑膜組織內(nèi)的炎細(xì)胞、滑膜細(xì)胞及毛細(xì)血管數(shù)量減少，滑膜增生及滑膜組織水腫明顯減輕，新生血管顯著減少，血管內(nèi)膜增厚減輕，少見(jiàn)血管翳形成，關(guān)節(jié)面破壞減輕。 3.外周血T細(xì)胞亞群的檢測(cè)結(jié)果：在免疫后45d，CIA組CD4、CD8與空白對(duì)照組相比均明顯升高；海蛇組與CIA組相比，CD4、CD8明顯下降，尤其是CD4顯著降低(P<0.01)，海蛇組與空白對(duì)照組相比較無(wú)顯著性差異。 4.血清中抗CⅡ抗體含量的檢測(cè)結(jié)果：C

12、IA組抗CⅡ抗體含量顯著升高，表明CⅡ可能是RA致病的潛在抗原。海蛇治療組抗Ⅱ型膠原抗體含量較CIA組明顯降低，表明海蛇組關(guān)節(jié)損傷較CIA組明顯減輕，釋放的Ⅱ型膠原減少。 5.血清中TNF-α、IFN-γ含量的檢測(cè)結(jié)果：CIA組血清中TNF-α含量較空白對(duì)照組顯著升高，TNF-α是一種主要的炎性因子，與VEGF的表達(dá)呈正相關(guān)，促進(jìn)滑膜血管增生，在RA的發(fā)病中起重要作用。海蛇治療組TNF-α含量較CIA組明顯降低，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著，

13、表明海蛇可通過(guò)多環(huán)節(jié)抑制新生血管生成。CIA組IFN-γ含量較空白對(duì)照組明顯升高，表明CIA主要表現(xiàn)為T(mén)h1型器官特異性的自身免疫病。海蛇乙醇提取物可通過(guò)調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，顯著降低IFN-γ的表達(dá)，從而阻斷了由IFN-γ大量分泌形成的惡性循環(huán)。海蛇治療組IFN-γ含量明顯低于CIA組，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著。 6大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜VEGF、Flk-1、Fit-4、Ang-2、Tie-2、TNF-α、IFN-γ陽(yáng)性細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果：CIA組VEGF、flk-

14、1、fit-4增高的同時(shí)，Ang-2、Tie-2表達(dá)亦增高，與空白對(duì)照組相比差異顯著，表明VEGF與Ang-2協(xié)同作用促進(jìn)新生血管生成。CIA組TNF-α、IFN-γ的陽(yáng)性表達(dá)較空白對(duì)照組明顯升高，TNF-α與VEGF的表達(dá)呈呈正相關(guān)關(guān)系。海蛇治療組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜VEGF及其受體Flk-1、Fit-4的表達(dá)與Ang-2、Tie-2的表達(dá)均明顯降低，且TNF-α、IFN-γ的表達(dá)顯著降低，與CIA組相比統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著。 結(jié)論