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文檔簡(jiǎn)介
1、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoidarthritis,RA)是一種以多對(duì)稱性關(guān)節(jié)炎為主要臨床表現(xiàn)的慢性自身免疫功能障礙性疾病。關(guān)節(jié)滑膜炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、血管新生增多、滑膜血管翳形成、軟骨及骨組織侵蝕是RA的主要病理學(xué)特征。血管新生是產(chǎn)生和維持RA血管翳的必需條件,因此,抑制血管新生可能是治療RA的一個(gè)新的靶點(diǎn)。本課題組前期體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)穿山龍總皂苷可以減少膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(collagen-inducedarthritis,CIA)大鼠
2、關(guān)節(jié)滑膜組織的新生血管數(shù)量,顯著性下調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)及其受體的表達(dá),進(jìn)一步證明了抑制血管新生可以作為治療RA的靶點(diǎn),抑制血管新生是穿山龍總皂苷治療RA的機(jī)制之一;在體外,IL-17聯(lián)合TNF-α能夠刺激大鼠滑膜細(xì)胞株RSC-364細(xì)胞分泌大量VEGF,此作用可以被核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nucleartranscriptionfactors-κB,NF-κB)特
3、異性阻斷劑PDTC部分阻斷,說明NF-κB途徑不是調(diào)控VEGF產(chǎn)生的唯一途徑;并且在實(shí)驗(yàn)中證實(shí)穿山龍總皂苷能夠抑制炎性因子誘導(dǎo)的RSC-364細(xì)胞VEGF的分泌。
本研究在前期對(duì)穿山龍總皂苷抑制血管新生作用的研究基礎(chǔ)上,以膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠(CIA)和大鼠滑膜細(xì)胞株RSC-364細(xì)胞模型為研究對(duì)象,通過體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)觀察穿山龍總皂苷對(duì)NF-κBp65、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活因子3(signaltransducerandacti
4、vatoroftranscription3,STAT3)及激活蛋白-1(activatorprotein-1,AP-1)表達(dá)的影響,進(jìn)一步闡明穿山龍總皂苷通過抑制血管新生治療RA的調(diào)控機(jī)制。
第一部分:穿山龍總皂苷對(duì)CIA大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織NF-κBp65、STAT3及AP-1表達(dá)的影響
目的:
通過觀察穿山龍總皂苷對(duì)膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(CIA)大鼠滑膜組織NF-κBp65、STAT3及AP-1表達(dá)的影響,深入
5、探討穿山龍總皂苷抑制類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎血管新生可能的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路作用機(jī)制。
方法:
健康清潔級(jí)Wistar大鼠100只,隨機(jī)取24只做正常對(duì)照組,其余76只大鼠均建立CIA模型。將造模成功的72只CIA大鼠隨機(jī)分為3組:CIA模型組、雷公藤組(陽性對(duì)照組)、穿山龍總皂苷組,每組24只。在初次免疫后第16d起,雷公藤組大鼠給予雷公藤多甙片(12mg·kg﹣1·d﹣1)灌胃,穿山龍總皂苷組大鼠給予穿山龍總皂苷(25mg·kg
6、﹣1·d﹣1)灌胃,正常組和CIA模型組大鼠分別給予等體積溶媒(0.5%CMC)灌胃,各組連續(xù)用藥時(shí)間均為35d。
分別于16d,23d,30d,37d,44d,50d觀察各組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)(arthritisindex,AI)評(píng)分的變化情況;應(yīng)用TransAMTMNF-κBp65活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)滑膜組織中NF-κBp65的DNA結(jié)合活性;免疫組織化學(xué)染色方法觀察滑膜組織中STAT3蛋白的表達(dá);原位雜交方法檢測(cè)滑膜組織AP-
7、1的兩個(gè)亞單位c-fos和c-jun的mRNA表達(dá)水平;凝膠電泳遷移率實(shí)驗(yàn)(electrophoreticmobilityshiftassay,EMSA)檢測(cè)滑膜組織核蛋白提取物AP-1的DNA結(jié)合活性。
結(jié)果:
1.大鼠治療前后不同時(shí)間點(diǎn)關(guān)節(jié)炎指數(shù)(AI)評(píng)分
大鼠初次免疫后14d逐漸出現(xiàn)足趾部及踝關(guān)節(jié)皮膚發(fā)紅,輕度腫脹等關(guān)節(jié)炎癥狀。造模成功分組以后分別于16d,23d,30d,37d,44d,50d檢測(cè)
8、各組大鼠AI評(píng)分,CIA模型組大鼠AI值在不同時(shí)間點(diǎn)與正常對(duì)照組相比均有顯著性差異(P<0.01);雷公藤組、穿山龍總皂苷組均可明顯抑制CIA大鼠AI值(P<0.01);兩治療組之間比較無顯著性差異(P>0.05)。
2.各組大鼠滑膜組織核蛋白提取物NF-κBp65的DNA結(jié)合活性
CIA模型組與正常對(duì)照組比較,大鼠滑膜組織核蛋白提取物中NF-κBp65的DNA結(jié)合活性顯著增高(P<0.01);與CIA模型組相比,雷
9、公藤組、穿山龍總皂苷組的NF-κBp65DNA結(jié)合活性均顯著降低(P<0.01);兩治療組之間比較無顯著性差異(P>0.05)。
3.各組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織STAT3蛋白的表達(dá)
STAT3免疫組化陽性產(chǎn)物黃色或棕黃色顆粒主要分布于細(xì)胞漿,少量在細(xì)胞核中。STAT3蛋白在CIA模型組大鼠關(guān)節(jié)滑膜中的表達(dá)與正常對(duì)照組相比顯著增多(P<0.01);與CIA模型組相比,雷公藤組、穿山龍總皂苷組STAT3蛋白的表達(dá)均顯著減少(P
10、<0.01);兩治療組之間兩兩比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
4.各組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中c-fosmRNA的表達(dá)
c-fosmRNA陽性信號(hào)主要分布于細(xì)胞漿,細(xì)胞漿顯黃色或棕黃色顆粒為陽性反應(yīng)。與正常對(duì)照組相比,CIA模型組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織可見到大量細(xì)胞漿染成棕黃色至棕褐色,c-fosmRNA的表達(dá)水平顯著增多(P<0.01);與CIA模型組相比,雷公藤組、穿山龍總皂苷組c-fosmRNA的表達(dá)水平均顯著減少(P
11、<0.01);兩治療組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
5.各組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中c-junmRNA的表達(dá)
c-junmRNA陽性反應(yīng)主要分布于細(xì)胞漿,細(xì)胞漿顯黃色或棕黃色顆粒。與正常對(duì)照組相比,CIA模型組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織可見到大量細(xì)胞漿染成棕黃色至棕褐色,c-junmRNA的表達(dá)水平顯著增多(P<0.01);與CIA模型組相比,雷公藤組、穿山龍總皂苷組c-junmRNA的表達(dá)水平均顯著減少(P<0.01);兩治
12、療組之間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
6.各組大鼠滑膜組織核蛋白提取物AP-1的DNA結(jié)合活性
與正常對(duì)照組比較,CIA模型組滑膜組織核蛋白提取物AP-1的結(jié)合活性顯著增高(P<0.01);與CIA模型組相比,雷公藤組、穿山龍總皂苷組的AP-1DNA結(jié)合活性均顯著降低(P<0.01)。
結(jié)論:
1.CIA模型大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)(AI)在16d、23d、30d、37d、44d、50d各時(shí)間點(diǎn)均高于
13、正常對(duì)照組,穿山龍總皂苷治療后可以降低CIA大鼠的AI值。
2.本研究首次證明穿山龍總皂苷灌胃給藥治療可以使CIA大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織NF-κBp65、AP-1的DNA結(jié)合活性及STAT3蛋白的表達(dá)顯著降低;c-fos和c-junmRNA的表達(dá)顯著減少,提示穿山龍總皂苷可以在體內(nèi)通過上述信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑影響血管新生關(guān)鍵因子VEGF的產(chǎn)生,從而起到抑制類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎血管新生的作用。
第二部分:穿山龍總皂苷含藥血清對(duì)IL-17和
14、TNF-α誘導(dǎo)的大鼠滑膜細(xì)胞株RSC-364NF-κBp65、STAT3及AP-1表達(dá)的影響
目的:
通過體外實(shí)驗(yàn)觀察穿山龍總皂苷含藥血清對(duì)IL-17和TNF-α聯(lián)合誘導(dǎo)的大鼠滑膜細(xì)胞株RSC-364NF-κBp65、STAT3及AP-1表達(dá)的影響,探討穿山龍總皂苷抑制類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎血管新生可能的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路作用機(jī)制。
方法:
制備穿山龍總皂苷和雷公藤(陽性對(duì)照)含藥血清;取大鼠滑膜細(xì)胞株RSC-
15、364經(jīng)IL-17(10μg/L)和TNF-α(10μg/L)、穿山龍總皂苷含藥血清、雷公藤多甙片含藥血清單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用孵育,孵育24h,提取各組細(xì)胞核蛋白用于TransAMTMNF-κBp65活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)NF-κBp65的DNA結(jié)合活性及EMSA方法檢測(cè)AP-1的DNA結(jié)合活性;提取各組細(xì)胞總蛋白后應(yīng)用Westernblot方法觀察STAT3蛋白的表達(dá)。
結(jié)果:
1.各組滑膜細(xì)胞核蛋白提取物NF-κBp65的
16、DNA結(jié)合活性
與空白對(duì)照組比較,IL-17+TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞模型組細(xì)胞核蛋白提取物中NF-κBp65的DNA結(jié)合活性顯著增高(P<0.01);與細(xì)胞模型組相比,雷公藤含藥血清組、穿山龍總皂苷含藥血清組的NF-κBp65DNA結(jié)合活性均顯著降低(P<0.01),且兩組之間比較無顯著性差異(P>0.05)。
2.各組滑膜細(xì)胞STAT3蛋白的表達(dá)
STAT3蛋白在細(xì)胞模型組的表達(dá)與空白對(duì)照組相比顯著增多(P
17、<0.01);與細(xì)胞模型組相比,雷公藤含藥血清組、穿山龍總皂苷含藥血清組STAT3蛋白的表達(dá)顯著減少(P<0.01),且兩組之間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
3.各組滑膜細(xì)胞核蛋白提取物AP-1的DNA結(jié)合活性
與空白對(duì)照組比較,細(xì)胞模型組滑膜細(xì)胞核蛋白提取物AP-1的DNA結(jié)合活性顯著增高(P<0.01);與細(xì)胞模型組相比,雷公藤含藥血清組、穿山龍總皂苷含藥血清組AP-1的DNA結(jié)合活性降低(P<0.05),
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