RNA干擾NF-κB p65、STAT3基因增強(qiáng)尼妥珠單抗在下咽癌FaDu細(xì)胞的抗腫瘤活性研究.pdf

1、背景：
　　頭頸鱗癌(head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC)的發(fā)生、發(fā)展是多種抑癌基因異常，同時(shí)伴隨多條增殖相關(guān)的分子通路持續(xù)性激活的過程。其中研究最多的是表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)通路，并且EGFR的高表達(dá)與疾病的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。EGFR的靶向治療或?qū)嶒?yàn)研究主要有:單克隆抗體和小分子酪氨酸激酶抑制劑。盡管EGFR的

2、靶向治療提高了進(jìn)展期以及復(fù)發(fā)腫瘤的生存期，但這部分病人的治療效果仍然很差。EGFR靶向治療耐藥性機(jī)制尚未完全明確，然而下游分子信號通路過度激活可能是耐藥機(jī)制之一。我們試圖通過聯(lián)合阻斷下游的NF-κ B以及STAT-3，進(jìn)一步促進(jìn)EGFR單克隆抗體尼妥珠誘導(dǎo)的下咽癌Fadu細(xì)胞系細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖。
　　目的：
　　探究聯(lián)合抑制NF-κB p65，STAT-3基因的表達(dá)增強(qiáng)尼妥珠單抗對下咽癌Fadu細(xì)胞系增殖的抑制作用，促

3、進(jìn)細(xì)胞凋亡。
　　方法：
　　1、向Fadu細(xì)胞中加入尼妥珠單抗:0ug/mL，50 ug/mL，ug/mL，100 ug/mL，200 ug/mL，72小時(shí)后蛋白免疫印跡法檢測EGFR，NF-κB p65，STAT-3的表達(dá)。針對NF-κB p65和STAT-3基因分別篩選4條擬干擾靶點(diǎn)，分別構(gòu)建這兩種基因的shRNA真核表達(dá)載體，以及一條不針對任何序列的陰性對照表達(dá)載體shRNA NC。利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染shRNA至293T

4、細(xì)胞，篩選出具有干擾效果的真核表達(dá)載體。
　　2、將篩選出的質(zhì)粒分為5組:①脂質(zhì)體(1 ug/mL)+shRNA p65;②脂質(zhì)體(1 ug/mL)+shRNA STAT-3;③脂質(zhì)體(1 ug/mL)+shRNA p65、STAT-3;④脂質(zhì)體(1 ug/mL)+shRNA NC;⑤shRNA p65、STAT-3+尼妥珠單抗(100ug/mL)。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后蛋白免疫印跡法檢測EGFR，NF-κB p65、STAT-3蛋白的表

5、達(dá)，于轉(zhuǎn)染48，72，96小時(shí)后檢測細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期。
　　結(jié)果：
　　1、加入尼妥珠單抗后Fadu細(xì)胞系EGFR的表達(dá)下降，同時(shí)NF-κB p65、STAT-3的表達(dá)明顯增加，并且呈劑量依賴型。成功構(gòu)建重組質(zhì)粒表達(dá)載體pGPU6/GFP/Hygro-p65、pGPU6/GFP/Neo-STAT-3以及pGPU6/GFP/Hygro-NC,NF-κB p65、STAT-3與對照組mRNA相比，分別下降至53.2％

6、和47.4％。
　　2、NF-κB p65、STAT-3靶向shRNA轉(zhuǎn)染后顯著降低了相應(yīng)蛋白的表達(dá)(p＜0.05)。同時(shí)干擾NF-κB p65、STAT-3基因表達(dá)組較單獨(dú)組均更加顯著抑制了FaDu細(xì)胞增殖促進(jìn)了凋亡(p＜0.01)。與聯(lián)合干擾組相比，加入尼妥珠單抗后較進(jìn)一步促進(jìn)凋亡(p＜0.01）。
　　結(jié)論：
　　同時(shí)干擾基因?qū)aDu細(xì)胞生長有顯著抑制作用，提示NF-κB p65、STAT-3可能作為下咽癌基因