紋狀體老化與病變的羰基應激機制及運動抗逆作用研究.pdf

1、增齡性老化是帕金森病(Parkinson's disease，PD)等神經退行性疾病的重要風險因素，神經退行或病變成為影響人口健康和生活質量的公共健康問題，更是一個值得科學研究的重大問題。推動PD等疾病相關基礎與臨床研究窗口前移勢在必行，本文從羰基應激等衰老共性生化過程出發(fā)，構建增齡性紋狀體老化模型和6-OHDA致帕金森疾病模型，進而通過規(guī)律有氧運動干預，探討紋狀體增齡性老化和PD發(fā)生過程中的羰基應激及相關調控機制、以及規(guī)律有氧運動對紋

2、狀體增齡性老化和PD的作用，致力于篩選神經退行性變早期的新的靶標，為PD的發(fā)生發(fā)展和運動延緩神經退行或PD病變的機制提供重要的理論意義與臨床指導意義。
　　方法:以SPF級雄性SD大鼠為研究對象。(1)將6月齡（青年）、16月齡（中年）和25月齡（老年）大鼠各分為兩組，對照組Y-SED、M-SED和O-SED靜息、運動組Y-EX、M-EX和O-EX實施10周遞增負荷規(guī)律的中等強度有氧運動干預。通過曠場實驗等進行行為學監(jiān)測，檢測血液

3、生化指標，以及紋狀體電鏡檢測和凋亡檢測等獲得相關體視學指標。采用改良親和素-生物素珠富集羰基蛋白質組學方法分析蛋白質的羰基化修飾機制，并用丹麥 Exiqon公司研發(fā)的miRNA微陣列芯片miRCURYTM LNA Array(v.18.0)等方法分析羰基化蛋白質的調控機制，用qRT-PCR、免疫組化(IHC)和免疫印跡(WB)等對篩選的相關通路的蛋白質進行驗證。(2)將16月齡大鼠分為PD安靜組(SED-PD)和運動組(EX-PD)，同

4、時組內以相應的正常側SED-NOR和EX-NOR作為對照，運動組經預先8周遞增負荷中等強度規(guī)律有氧運動后，兩組大鼠同時構建6-OHDA致使的PD病變模型。在確定PD大鼠模型造模成功后，采用(1)的方法分析PD過程中的羰基應激機制及運動干預的作用機制。
　　結果:(1)大鼠增齡過程中運動行為學、組織形態(tài)學和生物化學等相關指標發(fā)生老化退行性改變。水平繩實驗結果顯示各年齡安靜組大鼠出現(xiàn)增齡性下降趨勢顯著(P＜0.05)。電鏡觀察老年大鼠

5、紋狀體的絨毛排列明顯混亂，絨毛疏松，絨毛上面或者之間結節(jié)狀突觸較少，絨毛的光滑程度下降。增齡大鼠紋狀體均出現(xiàn)細胞凋亡核，凋亡發(fā)生率為100％,呈現(xiàn)增齡性趨勢。與Y-SED相比較，M-SED細胞凋亡指數(shù)增加了288.88％(P＜0.05)，而O-SED細胞凋亡指數(shù)增加了392.22％(P＜0.05)。與Y-SED組相比較，M-SED和O-SED組的細胞自噬因子(Beclin1)/β-actin比值上升趨勢(P＜0.05)，與凋亡呈高度相關

6、。
　　改良親和素-生物素珠富集羰基化蛋白質經ESI-Q-TOF-MS/MS鑒定，發(fā)現(xiàn)羰基化蛋白質沒有呈現(xiàn)增齡性遞增變化，羰基化修飾對蛋白質具有選擇性，蛋白質的相對數(shù)量并不是蛋白質羰基化程度的決定因素;得出青年大鼠羰基化蛋白質數(shù)量78個、老年次之69個和中年52個，而氧化修飾位點的羰基化蛋白質鑒定率中年最高76.47％、老年次之72.63％和青年最低69.65％。主要涉及能量代謝、線粒體內膜、ATP酶活性、黑質發(fā)育、突觸傳導調節(jié)、

7、軸突部位和老化等。增齡性老化過程中具有重要作用的羰基化蛋白質與AMPK、CaMK和PI3R/Akt/mTOR信號通路網絡密切相關。與Y-SED和M-SED組相比較，O-SED組的AMPKα1/β-actin比值上升趨勢(P＜0.05);CaMKⅡα和Vdac1的表達呈現(xiàn)年齡增齡性趨勢，與Y-SED相比較，M-SED和O-SED的CaMKⅡα和Vdac1表達顯著上調(P＜0.05);PI3K、Akt和mTOR表達呈現(xiàn)隨著年齡增齡性下調，與

8、Y-SED相比較，O-SED的PI3K、Akt和mTOR表達顯著下調(P＜0.05)。表明這三條信號通路參與調節(jié)增齡過程中紋狀體細胞凋亡與自噬的平衡穩(wěn)定，從而影響增齡性老化的發(fā)生發(fā)展。
　　(2)從掃描電子顯微鏡觀察得出，與Y-SED組相比，Y-EX組大鼠紋狀體的絨毛列規(guī)則并緊密，結節(jié)狀的數(shù)量更多，而且體積更大;M-EX和O-EX組與相應的M-SED和O-SED組相比較，絨毛列緊密，結節(jié)狀的數(shù)量更多。規(guī)律有氧運動提高了各年齡大鼠紋

9、狀體BDNF的表達水平(P＜0.05)，呈現(xiàn)年齡增齡性趨勢。規(guī)律有氧運動本身對大鼠血液內氧化應激相關指標的變化與組織中的相應指標的變化趨勢不同，呈現(xiàn)了其本身是一種應激刺激。實施規(guī)律有氧運動的各年齡組大鼠紋狀體細胞凋亡指數(shù)分別增加了205.56％、57％和68.24％(P＜0.01)。而Beclin1/β-actin比值均顯著上升(P＜0.05)，其中M-EX和O-EX組顯著增加(P＜0.01)。
　　質譜鑒定出規(guī)律有氧運動對線粒體

10、和黑質發(fā)育相關信號轉導的蛋白質羰基化產生了一定的影響，改善了與老化過程有關的鈣網蛋白、與DNA有重要關系的核內不均一核糖核蛋白A2/B1等、與黑質發(fā)育及突觸密切相關的14-3-3蛋白等的羰基化。芯片結果顯示規(guī)律有氧運動上調miRNA207和下調miRNA542的表達，涉及與神經老化或者神經退行有著密切關系的刺激神經系統(tǒng)配合受體相互作用通路、鈣調信號通路、γ-氨基丁酸突觸信號通路和糖酵解信號通路等。結果顯示規(guī)律有氧運動使大鼠紋狀體AMPK

11、α1/β-actin比值均顯著上升(P＜0.05)，呈現(xiàn)了增齡性趨勢，與相應的安靜組相比較，Y-EX、M-EX和O-EX組的AMPKα1/β-actin分別上升46.18％、62.85％和22.84％(P＜0.05);各年齡安靜組與運動組相比較，CaMKⅡα和Vdac1的表達顯著上調(P＜0.05)，其中M-EX比 M-SED的上調具有非常顯著性(P＜0.01); M-EX和O-EX與相應的M-SED和O-SED相比較，PI3K、Akt

12、和mTOR表達上調，其中與O-SED相比較，O-EX的PDK、Akt和mTOR表達上調顯著(P＜0.01)。得出規(guī)律有氧運動有利于紋狀體的生物學功能和改善神經老化的機制，是通過激發(fā)大鼠紋狀體的AMPK、CaMK和PI3K/Akt/mTOR信號通路共同參與了運動可以調控細胞自噬與凋亡發(fā)生的平衡穩(wěn)態(tài)。
　　(3)6-OHDA致PD大鼠的模型構建成功，造模過程中沒有引起醫(yī)源性的炎癥反應和大面積細胞凋亡或壞死;掃描電鏡結果發(fā)現(xiàn)紋狀體軸突與

13、神經絨毛的萎縮等形態(tài)學改變與帕金森病的發(fā)生有著密切關系。采用透射電子顯微鏡和TUNEL均可觀察到凋亡細胞核，PD模型大鼠紋狀體的細胞凋亡發(fā)生率為100％。SED-NOR組比正常安靜組M-SED組的凋亡指數(shù)上升顯著(P＜0.01)。與SED-NOR組相比，SED-PD組的凋亡指數(shù)上升40.72％(P＜0.01)。免疫印跡結果顯示，與SED-NOR組相比較，SED-PD組的Beclin1/β-actin比值下降(P＜0.05)。
　　

14、質譜鑒定出PD病交過程中具有重要作用的羰基化蛋白質涉及線粒體內膜、能量代謝、黑質發(fā)育、突觸傳導調節(jié)、微管、肌動蛋白細胞骨架等相關調節(jié)蛋白。與SED-NOR相比較，SED-PD的AMPK表達明顯上升(P＜0.01);與SED-NOR相比較，SED-PD的CaMKⅡα、CaMKV和Vdac1表達明顯上調(P＜0.01);與SED-NOR相比較，SED-PD的PI3R、Akt和mTOR表達明顯上調(P＜0.01)。得出紋狀體神經細胞自噬的障礙

15、與PD的發(fā)生發(fā)展有著密切的關系，可以促進細胞凋亡，而AMPK通路與CaMK信號通路的下調一定程度促進了凋亡的發(fā)生率，對于PD病變的調控起著重要的作用。
　　(4)預先規(guī)律有氧運動提高了6-OHDA致帕金森大鼠的損傷抗逆能力;對ATP酶活性和酰胺結合相關信號轉導的蛋白質羰基化有一定的影響，改善了與老化及退行性疾病有關的CamⅡα、 HSP60、Syn1、Map1和Map2蛋白被羰基化;通過上調miRNA3557和下調miRNA324

16、，調節(jié)與帕金森有著密切關系的刺激神經系統(tǒng)配合受體相互作用通路、鈣調信號通路、糖基磷脂酰肌醇生物合成、細胞內吞作用和核苷酸切除修復等。與EX-NOR組相比較，EX-PD組的AMPKα1/β-actin比值上升(P＜0.05);與SED-PD組相比較，EX-PD組的AMPKα1/β-actin比值卻出現(xiàn)下降(P＜0.05)。與SED-NOR相比較，EX-NOR的CaMKⅡα、CaMKV和Vdac1的表達都明顯下調(P＜0.01);與SED-

17、PD相比較，EX-PD的CaMKV和Vdac1表達稍微下調(P＞0.05)，只有EX-PD的CaMKⅡα表達稍微上升(P＞0.05)。與EX-NOR相比，EX-PD的PI3R、Akt和mTOR表達也明顯上調(P＜0.01)。但是與SED-PD相比較，EX-PD的PI3R和mTOR表達稍微上調(P＞0.05)，而Akt卻明顯下調(P＜0.01)。與SED-PD相比較，EX-PD的Syp和Ywhah表達顯著下調(P＜0.05，P＜0.01)

18、，其中UCH-L1表達上調(P＜0.05)。得出預先規(guī)律有氧運動誘導了PD大鼠紋狀體的自噬與凋亡適當增加，下調了AMPK通路與CaMK信號通路，而激活了PI3R/Akt/mTOR信號通路，PI3R/Akt/mTOR協(xié)調AMPK通路與CaMK信號通路網絡的調控，從而提高了UCH-L1表達水平與細胞自噬一起聯(lián)合抑制PD病變的發(fā)生或發(fā)展。
　　結論:增齡性老化與帕金森病變的發(fā)生發(fā)展過程中，羰基化修飾對蛋白質具有選擇性，蛋白質的相對數(shù)量并

19、不是蛋白質羰基化程度的決定因素，而與AMPK、CaMK和PI3R/Akt/mTOR信號通路網絡的相關蛋白質羰基化有著密切關系。規(guī)律有氧運動延緩神經退行及病變的適應性機制是一種抗逆鍛煉作用機理:運動使能量-氧應激穩(wěn)態(tài)的適應性變化，而AMPK、CaMK和PI3K/Akt/mTOR信號通路的相關蛋白質羰基化修飾，啟動miRNA調控其靶通路之一CaMK信號通路，協(xié)調該通路有密切相關的AMPK通路與PI3K/Akt/mTOR通路的相關蛋白表達，從