蛋白激酶TTK的動力學研究及其羧基末端D domain在其激酶活性中作用的研究.pdf

1、細胞周期調控在生物細胞中起著十分重要的作用，它調節(jié)著細胞的生長和分化。如果細胞周期調控出錯會導致許多嚴重的后果，從而最終引發(fā)癌癥。例如：在有絲分裂過程中細胞周期錯誤會引起基因組的不穩(wěn)定或者染色體分離的異常。而有絲分裂過程受到許多蛋白激酶的調控，這些激酶的分子機制及信號傳導通路有待被研究。因此，研究有絲分裂過程中起調控作用的蛋白激酶的分子機制有十分重要的意義，而且有助于進一步了解有絲分裂激酶在癌癥中的作用。
　　 在有絲分裂過程中

2、起調節(jié)作用的一種激酶叫TTK/Mps1。它由MPS1(MonoPolar Spindle1)基因編碼，是一種重要的具有雙重專一性的蛋白激酶，該酶對于肽鏈中的絲氨酸，蘇氨酸以及酪氨酸殘基具有專一性的磷酸化作用。該酶在真核生物的進化上十分保守。最近，蛋白激酶TTK已經被認為是生物基因穩(wěn)定性的關鍵調節(jié)因子，因為它調節(jié)著許多細胞有絲分裂的重要步驟。例如：TTK不僅是紡錘體檢驗點的重要組成成分，而且能夠修正錯誤的染色體排列。其激酶活性是檢驗點信號

3、傳導所必需的，他在有絲分裂中能夠確保染色體的正常分離。在細胞周期中，TTK活性的喪失會導致減數(shù)分裂錯誤，出現(xiàn)非整倍體，這通常會導致癌癥的產生，因為不正常的細胞分裂是癌細胞的一個顯著特點。研究表明Mps1可以作為一種治療癌癥的新手段，然而這種治療方法的成功運用，需要對蛋白激酶TTK的活性有更加深入的研究。本文主要的工作內容及結果如下：
　　 1.利用病毒表達體系從昆蟲Highs細胞中純化得到TTK蛋白激酶。
　　 為了研究

4、TTK激酶活性的動力學機制和酶學特征，本論文首先利用病毒表達體系在昆蟲high5細胞中對TTK進行了有效地表達與純化。這就克服了從E.coli中純化的TTK，由于缺少必要的后翻譯修飾，酶活性低的缺點。由于TTK比較容易降解，在構建載體時，分別在TTK的N末端加了GST-tag和在C末端加了His-tag。因此可以采用兩步連續(xù)純化的方法，得到均一的全長TTK。第一步，先用GST純化，并用3C蛋白酶在柱切割以去除GST標簽，然后第二步用Ni

5、+柱進行his純化，接著用thrombin蛋白酶切除His標簽，最后純化得到有活性的全長TTK蛋白激酶用于酶的動力學研究。為了研究D domain在TTKA蛋白激酶磷酸化活性中的作用，同時構建了去除D domain的突變體(TTK-d)，并得到分離純化。
　　 2.對Hela細胞中內源TTK進行定量，結果表明TTK的蛋白水平受細胞周期的調控。
　　 然后，為了證實TTK的蛋白水平是否受細胞周期進程的調控以及它是否在中心體

6、復制過程中起重要作用，觀測了有絲分裂的Hela細胞在整個細胞周期中的TTK蛋白水平的變化，并測定了在不同細胞周期進程中內源TTK的濃度。結果顯示，TTK的蛋白水平在有絲分裂間期很低，但是在有絲分裂期也就是紡錘體檢驗點的活躍期其蛋白水平會增加。實驗結果顯示在正常的細胞周期過程中，G1/S期時細胞內的TTK濃度瞬時增加，在G2/M期達到最大值，然后在G1期又回到最低的初始水平以進入下一個細胞周期。TTK的這種變化趨勢與另外兩種調控有絲分裂的

7、關鍵蛋白-CyclinB和Cdk的變化趨勢是相似的。這些結果說明TTK水平受細胞周期的調控，另外，TTK蛋白水平的增加也與中心體復制的時間相一致，因此，該實驗結果可以作為中心體復制需要TTK活性的一個新證據(jù)。
　　 3.激酶實驗表明TTK自身磷酸化的分子機制是分子間相互作用，而且TTK的自身磷酸化能夠增強其對底物的磷酸化。
　　 本論文還對TTK的自身磷酸化的分子機制，即該酶的自身磷酸化是分子內還是分子間的相互作用進行了

8、研究。結果表明TTK的自身磷酸化的速率取決于TTK的濃度，它隨著TTK蛋白濃度的增加而增加，這一結果證明了TTKA的自身磷酸化的機制是酶分子之間的一種作用，因為如果是分子內的作用，自身磷酸化的速率將不會隨著酶分子濃度的變化而變化。此外，本論文對該酶的自身磷酸化作用和底物磷酸化作用之間的關系進行了研究。將已經先自身磷酸化的TTK和未自身磷酸化的TTK分別作用于底物TTKA，實驗結果表明TTK的自身磷酸化作用會增強其對底物的磷酸化作用。這就

9、使得其催化的反應速率曲線由Lag變成了直線，這也正是自身磷酸化是分子間作用的蛋白激酶的普遍現(xiàn)象。
　　 4.動力學研究表明TTK蛋白激酶的催化機制是序列反應。
　　 為了更深入地闡述TTK磷酸化活性的催化機制，用放射性同位素活性測定的方法，測定了TTK對底物磷酸化作用的動力學參數(shù)。并用雙底物試驗測定了TTK的穩(wěn)態(tài)動力學參數(shù)。通過不同的ATP濃度和不同的底物TTKA的雙底物試驗，測得TTK對ATP和TTKA兩種底物的Km值

10、分別是54uM和74uM，經用MATLAB軟件對多組試驗數(shù)據(jù)的非線性擬合分析，結果表明直線都相交于一點，這說明TTK的酶學機制是三重復合物機制，而且在兩個底物之間有消極的相互作用。
　　 5.對突變體(TTK-d)的研究表明TTK羧基末端的D domain在酶對底物的磷酸化過程中起促進作用。
　　 本論文研究了TTK羧基末端的D domain(aa792-853)在酶的底物磷酸化中的作用，首先構建了敲除D domain的

11、TTK突變體(TTK-d)，并用與野生型TTK相同的方法在昆蟲High5細胞中過量表達，純化。純化得到的TTK-d突變體與野生型TTK相比，突變體的自身磷酸化活性沒有顯著變化但對底物的磷酸化活性降低3-5倍。這就表明D domain對酶的自身磷酸化沒有太大影響，但對于酶的底物磷酸化有一定作用。最后，本論文也對TTK-d進行了雙底物穩(wěn)態(tài)動力學參數(shù)測定與分析。TTK-d的ATP的Km和TTK-wt基本相當，但TTK-d對另一底物TTKA的K

12、m(130μM)值比wt的高，說明TTK-wt對TTKA有更高的結合。由此推測，D domain中的氨基酸殘基可能與catalytic domain的氨基酸殘基相互作用以有利于酶與底物TTKA的結合，從而提高酶的活性。
　　 總之，本論文首次對TTK激酶活性的動力學機制進行了研究，通過雙底物動力學分析闡明了TTK是序列反應催化機制并且推測了羧基末端的D domain在TTK激酶活性中的作用。該研究結果為人類蛋白激酶家族的研究打下