實(shí)時(shí)三維超聲對晚孕胎鼠大腦神經(jīng)細(xì)胞的生物學(xué)影響.pdf

1、超聲波用于診斷疾病及產(chǎn)前診斷已近45年的歷史，其對人體產(chǎn)生的生物效應(yīng)及安全性始終是人們關(guān)注的焦點(diǎn)，經(jīng)過多年的研究人們認(rèn)識到診斷級超聲波輻照劑量存在著時(shí)間一強(qiáng)度關(guān)系，即大劑量、高強(qiáng)度的超聲對機(jī)體組織可瞬間產(chǎn)生損害作用，小劑量、低強(qiáng)度超聲波長時(shí)間輻照也會對人體組織產(chǎn)生不良后果。超聲安全問題實(shí)際上就是產(chǎn)科胚胎和胎兒的超聲檢查安全的問題，因?yàn)樵谠缭衅谥灰獛讉€(gè)胚胎細(xì)胞受損，就有可能造成嚴(yán)重的不良后果，如畸形和缺陷，因此有許多超聲工作者對超聲的生物

2、學(xué)損害做了大量研究。隨著電子與計(jì)算機(jī)技術(shù)的不斷進(jìn)步超聲在產(chǎn)科領(lǐng)域的檢查類型也不斷更新，早期使用的是二維B型超聲（黑白超聲）用以觀察胎兒的切面圖像，隨后又發(fā)明了頻譜多普勒和彩色多普勒用以觀察臍帶血流及胎兒心血管的血流情況。上述的幾種超聲檢查技術(shù)已有大量的研究成果，也基本得出了相應(yīng)的結(jié)論，近年來由于三維超聲和四維超聲（實(shí)時(shí)三維超聲）不斷用于產(chǎn)前超聲診斷，總的超聲輻照時(shí)間延長，為胎兒的安全性帶來了潛在的危害，因此，對后兩種超聲檢查技術(shù)作用于胚

3、胎后所產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)及其危害做相應(yīng)的研究是一項(xiàng)緊迫的任務(wù)。以往的學(xué)者對超聲的生物學(xué)損害主要是做臨床上的病例對照研究和隊(duì)列研究，自韓國學(xué)者Oh等人應(yīng)用凋亡細(xì)胞做研究后認(rèn)為超聲輻照后檢測細(xì)胞凋亡率可作為確定超聲檢查是否安全的一個(gè)生物學(xué)指標(biāo)。從此各國學(xué)者應(yīng)用電鏡技術(shù)或多種組織化學(xué)方法來確定超聲輻照后組織器官中的細(xì)胞凋亡率，以獲得各自研究的相關(guān)數(shù)據(jù)。如應(yīng)用透射電鏡技術(shù)方法、應(yīng)用原位末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記法（TUNEL）、應(yīng)用Caspase酶

4、測定法間接確定凋亡細(xì)胞情況等。美國學(xué)者Ang等人運(yùn)用組織化學(xué)手段來確定孕小鼠經(jīng)超聲輻照后對胎鼠大腦神經(jīng)元遷移的影響。這些研究為機(jī)體超聲生物學(xué)效應(yīng)的研究開辟了新的領(lǐng)域。
　　 本研究分為三個(gè)部分，第一部分是利用光學(xué)顯微鏡、透射電子顯微鏡技術(shù)觀察孕小鼠接受不同時(shí)間段實(shí)時(shí)三維超聲輻照后對胎鼠大腦神經(jīng)細(xì)胞的生物學(xué)影響，主要觀察病理損害和凋亡細(xì)胞情況等形態(tài)學(xué)改變。第二部分是利用原位末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記法、Caspase3，9酶活性測定

5、來確定實(shí)時(shí)三維超聲輻照后小鼠大腦神經(jīng)細(xì)胞的凋亡情況及相關(guān)酶的表達(dá)。第三部分是在實(shí)時(shí)三維超聲輻照前給予孕16d母鼠DNA復(fù)制標(biāo)記物BrdU，標(biāo)記胎鼠大腦腦室附近的未分化神經(jīng)細(xì)胞，不同時(shí)間段實(shí)時(shí)三維超聲輻照后在生后第10d觀察幼鼠那些被BrdU標(biāo)記的大腦神經(jīng)細(xì)胞的遷移情況。
　　 第一部分實(shí)時(shí)三維超聲對晚孕胎鼠大腦神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響目的：探討不同實(shí)時(shí)三維超聲輻照劑量對晚孕胎鼠大腦神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變的觀察。
　　 方法：30

6、只孕鼠隨機(jī)等量分配到對照組、假輻照30min組、輻照5min組、輻照10min組、輻照20min組及輻照30min組。輻照組在孕鼠孕16d時(shí)行實(shí)時(shí)三維超聲輻照。假輻照組實(shí)施輻照操作，但儀器不發(fā)射超聲波。每組選生后24h乳鼠10只，取大腦右側(cè)項(xiàng)葉做標(biāo)本，透射電鏡下觀察。其余乳鼠于生后10d行灌流固定，取大腦標(biāo)本，HE染色光鏡觀察。
　　 結(jié)果：光鏡結(jié)果：對照組、假輻照組、輻照5min組及輻照10min組光鏡觀察未見明顯異常，輻照2

7、0min組及30min組，神經(jīng)細(xì)胞排列紊亂，部分神經(jīng)細(xì)胞壞死。電鏡結(jié)果：對照組、假輻照組、輻照5min組未見明顯異常；輻照10min組可見部分線粒體膨大，嵴斷裂，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)呈空泡化，偶見凋亡細(xì)胞；輻照20min、30min組線粒體與粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)異常改變增多，細(xì)胞核異染色質(zhì)凝集、邊集，觀察到典型的凋亡小體，凋亡細(xì)胞明顯增多。
　　 結(jié)論：實(shí)時(shí)三維超聲輻照超過10min可引起大腦神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)改變和凋亡細(xì)胞增加。
　　 第二部分實(shí)時(shí)

8、三維超聲輻照后TUNEL法及Caspase3、Caspase9免疫組織化學(xué)技術(shù)觀察小鼠大腦組織中細(xì)胞凋亡變化目的：探討實(shí)時(shí)三維超聲輻照后小鼠大腦細(xì)胞凋亡及Caspase3、Caspase9的表達(dá)及其意義。
　　 方法：30只孕鼠隨機(jī)等量分配到對照組、假輻照30min組、輻照5min、輻照10min、輻照20min及輻照30min組。輻照組在孕鼠孕16d時(shí)行實(shí)時(shí)三維超聲輻照，假輻照組實(shí)施輻照操作，但儀器不發(fā)射超聲波。每組選生后10

9、d乳鼠10只，行灌流固定，取大腦標(biāo)本，HE染色光鏡觀察、原位末端標(biāo)記（TUNEL）法檢測凋亡大腦細(xì)胞、比色法測定Caspase3和Caspase9活性。
　　 結(jié)果：TUNEL法標(biāo)記結(jié)果：輻照5min組凋亡細(xì)胞表達(dá)率與對照組和假輻照組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。輻照10min組凋亡細(xì)胞開始增多，輻照20min、30min組凋亡細(xì)胞表達(dá)率明顯增強(qiáng)，與其他各組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；Caspase3和Caspase9結(jié)果：Caspase

10、3平均光密度及Caspase9陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)均隨著輻照時(shí)間的延長而增強(qiáng)、增多，除對照組與假輻照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，其他各組兩兩比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論：實(shí)時(shí)三維超聲輻照可引起小鼠大腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡增加，相關(guān)凋亡基因Caspase3、Caspase9蛋白合成增加，活性升高，誘發(fā)神經(jīng)細(xì)胞凋亡。
　　 第三部分三維超聲輻照后對晚孕胎鼠大腦神經(jīng)細(xì)胞遷移的影響目的：對晚孕小鼠進(jìn)行不同時(shí)間段實(shí)時(shí)三維超聲輻照后觀察幼鼠大腦神經(jīng)

11、細(xì)胞遷移的情況。
　　 方法：30只孕鼠隨機(jī)等量分配到對照組、假輻照30min組、輻照5min、輻照10min、輻照20min及輻照30min組。輻照組在孕鼠孕16d時(shí)行實(shí)時(shí)三維超聲輻照，在輻照前24h、16h、8h分別在孕鼠腹腔內(nèi)注射BrdU50mg/kg，假輻照組和對照組也在孕16d時(shí)每8h腹腔注射5-溴脫氧尿苷嘧啶（BrdU）50mg/kg，共注射3次。假輻照組實(shí)施輻照操作，但儀器不發(fā)射超聲波。每組選生后10d乳鼠10只，

12、行灌流固定，取大腦標(biāo)本，HE染色光鏡觀察，行抗BrdU免疫組化染色，觀察大腦皮層各部BrdU陽性細(xì)胞數(shù)及分布情況，并比較它們之間的差異。
　　 結(jié)果：輻照組BrdU陽性細(xì)胞到達(dá)大腦皮質(zhì)淺層減少，停留在深層較多，隨著輻照時(shí)間的延長，此種情況越來越明顯，對照組和假輻照組之間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，對照組與各輻照組，假輻照組與各輻照組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。大腦皮質(zhì)深層（6～10層）BrdU+細(xì)胞陽性率的構(gòu)成比較對照組、假輻照組與各輻照組間差別