調節(jié)NMD通路中SMG5的miR-433的鑒定及miRNA-NMD-作用底物調控通路的初步研究.pdf

1、在真核細胞的進化過程中形成許多mRNA質量監(jiān)控機制來實現基因的準確表達，其中無義介導的mRNA降解（nonsense-mediatedmRNAdecay,NMD）是一種重要的轉錄后監(jiān)控機制，可識別含提前終止密碼子（prematureterminationcodons，PTC）的異常mRNA并對其進行降解，有效避免產生的截短蛋白對細胞的毒害。其中，SMG5在NMD中扮演著重要的角色，SMG5是一個編碼蛋白基因，沒有核糖核酸酶活性，但對逆轉

2、錄酶的活性有促進作用，它和SMG7一起被認為與涉及核酸外切途徑的mRNA降解機制存在聯系—通過招募磷酸酯酶2A(PP2A)引起UPF1的脫磷酸化。
　　microRNA(miRNA)是一類長度約為19-24nt內源性保守單鏈非編碼小分子RNA。miRNA通過與靶基因mRNA的3'UTR特異互補結合，在轉錄后水平上調節(jié)靶mRNA的表達或者阻止蛋白的翻譯，目前研究表明，miRNA參與了許多生理及病理的過程，例如，參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展和

3、轉移、細胞凋亡、細胞增殖和分化的生物化學過程等。但是目前有關miRNA參與NMD通路的報道比較少，因此，作用于NMD通路中的主要因子的miRNAs是不是介導mRNA的降解是一個值得研究的課題，本試驗以NMD通路中的關鍵因子SMG5為研究對象，通過生物信息學的方法篩選出潛在的以SMG5為靶基因的miR-433。并利用分子生物學方法研究二者的作用關系，以及在NMD通路中所發(fā)揮的作用。主要的研究結果如下:
　　(1)生物信息學預測潛在調

4、控SMG5的miRNAs。利用生物信息學軟件TargetScan等對作用于SMG53'UTR的miRNA進行預測，結果得到了多個miRNAs，經過篩選最終確定miR-433作為研究對象。
　　(2)組織表達譜的構建。利用實時定量PCR技術檢測miR-433和SMG5在小鼠心、肝、腎等十二種組織的表達量，并繪制了組織表達譜。結果顯示:SMG5基因在小鼠組織中廣泛表達，miR-433在腦和肌肉中表達量較高。
　　(3)雙熒光素酶

5、報告基因的檢測。根據miR-433與SMG5基因的3'UTR結合序列，構建了野生型和突變型熒光素酶報告基因pmirGLO載體。并將這兩種質粒分別與miR-433mimic和miR-433inhibitor共轉入HEK-293T細胞、Hela細胞，檢測相應的熒光活性，結果表明:miR-433與SMG5之間存在負調控的關系。
　　(4)miR-433調控SMG5的表達檢測。miR-433mimic轉染BHK細胞后，利用RT-PCR和W

6、esternblot檢測SMG5的表達量，結果發(fā)現:SMG5的mRNA表達量顯著下降(P＜0.01)，miR-433也降低了SMG5蛋白水平;而將miR-433inhibitor轉染C2C12細胞后，得到的結果剛好相反，SMG5的表達量顯著上升(P＜0.01)，miR-433inhibitor上調了SMG5的蛋白水平。
　　(5)利用熒光定量PCR和westernbolt檢測miR-433調控SMG5底物基因GADD45B、TBL

7、2的表達。將miR-433mimic轉染細胞后，利用熒光定量PCR和westernbolt檢測NMD中SMG5底物基因TBL2、GADD45B的表達，結果顯示:miR-433上調了TBL2、GADD45B的表達，進一步推斷miR-433參與NMD通路。
　　(6)干擾SMG5對底物基因的影響。利用SMG5基因的siRNA，轉染C2C12細胞，實時熒光定量PCR檢測SMG5被干擾后底物基因TBL2、GADD45B的表達量，結果顯示: