食管鱗癌中RASSF5不同轉(zhuǎn)錄本的表達及其表觀遺傳學失活機制的研究.pdf

1、目的:食管癌是人類常見的惡性腫瘤之一，我國是世界食管癌的高發(fā)國。中國北方地區(qū)尤其是沿太行山脈的河南河北等地是食管癌高發(fā)區(qū)之一，以食管鱗癌最常見。食管癌癥狀隱匿，就診時多處于中晚期，相當部分的病人已不能手術治療，預后較差，因此提高食管癌早期診斷率和加強病因?qū)W研究以便進行一級預防，十分必要。目前普遍認為食管癌是多因素、多基因、多階段的復雜發(fā)生發(fā)展過程，其病因和發(fā)病機制尚未完全闡明。
　　除DNA核苷酸序列改變可影響腫瘤發(fā)生發(fā)展外，表觀

2、遺傳學機制在腫瘤形成過程中的作用越來越受到重視。DNA甲基化是最早發(fā)現(xiàn)的基因修飾途徑之一，是表觀遺傳學的重要組成部分，在維持正常細胞功能、胚胎發(fā)育及腫瘤發(fā)生中起著重要作用。腫瘤相關基因DNA甲基化狀態(tài)的改變在腫瘤中普遍存在，DNA甲基化在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用是當前的研究熱點。研究發(fā)現(xiàn)腫瘤的發(fā)生可能與抑癌基因啟動子區(qū)CpG島甲基化造成的抑癌基因失活有關，因此抑癌基因是目前腫瘤甲基化研究的主要熱點。RASSF5（又名NORE1）是Ras相關

3、區(qū)域家族中的一個成員，是鼠類Ras受體Nore1的人類同系物，位于染色體1q32.1。由于選擇性剪接和不同的啟動子使用，RASSF5包含三種不同的轉(zhuǎn)錄本，RASSF5A、RASSF5B和RASSF5C。它們的外顯子各不相同，RASSF5A包含外顯子1、2、4、5、6、7，RASSF5B包含外顯子1、2、4、5、7，RASSF5C包含外顯子3、4、5、6、7。不同的轉(zhuǎn)錄本在食管鱗癌中所起的作用可能不同。本研究通過檢測食管鱗癌組織中RASS

4、F5基因不同轉(zhuǎn)錄本的mRNA表達，確定相應表達轉(zhuǎn)錄本后再研究此轉(zhuǎn)錄本在食管癌細胞中的mRNA表達及其甲基化狀態(tài)，在食管鱗癌組織中的蛋白表達情況以及甲基化狀態(tài)，探討RASSF5基因不同轉(zhuǎn)錄本在食管鱗癌中的表達及臨床意義。
　　方法:
　　1應用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(reverse transcription polymerase chainreaction，RT-PCR)技術分別檢測49例食管鱗癌組織及癌旁正常組織中 RASS

5、F5基因不同轉(zhuǎn)錄本的mRNA表達情況以及DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-氮雜-2'-脫氧胞苷（5-aza-2'-deoxycitydine，5-aza-dC）處理前后的食管癌細胞系(TE1、TE13、T.Tn、Ec109)中RASSF5A的mRNA表達情況。
　　2應用甲基化特異性PCR(methylation specific polymerase chain reaction，MSP)技術分別檢測應用5-aza-dC處理前后的食管癌

6、細胞系和49例食管鱗癌組織及癌旁正常組織中RASSF5A基因的甲基化狀態(tài)。
　　3應用免疫組織化學(immunohistochemistry) SP法檢測49例食管鱗癌組織及癌旁正常組織中RASSF5A蛋白的表達情況。
　　4運用統(tǒng)計軟件SPSS13.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。
　　結果:
　　1食管鱗狀上皮組織中RASSF5不同轉(zhuǎn)錄本的mRNA表達
　　RASSF5A轉(zhuǎn)錄本是主要在食管鱗狀上皮中表達的轉(zhuǎn)錄本

7、，轉(zhuǎn)錄本RASSF5B和RASSF5C在食管鱗狀上皮中的表達均很低。
　　2食管癌細胞中RASSF5A的mRNA表達及甲基化狀態(tài)
　　2.15-aza-dC處理前后食管癌細胞系中RASSF5A的mRNA表達
　　四株未處理的食管癌細胞株中，TE1、Ec109細胞株中RASSF5A基因mRNA表達呈弱陽性，TE13、T.Tn細胞株中RASSF5A基因表達缺失，用甲基化抑制劑5-aza-dC處理后，TE1、Ec109細胞株

8、中RASSF5A基因表達增高，TE13、T.Tn細胞株中均檢測出RASSF5A mRNA的表達。
　　2.25-aza-dC處理前后食管癌細胞系中RASSF5A的甲基化狀態(tài)
　　四株未處理的食管癌細胞系中，TE1細胞中RASSF5A基因表現(xiàn)出不完全甲基化，其余三株細胞系中RASSF5A基因啟動子區(qū)呈高甲基化狀態(tài)，應用甲基化抑制劑5-aza-dC處理后，TE1細胞株中RASSF5A基因甲基化程度降低，非甲基化程度增加，其余三種

9、細胞株中RASSF5A基因均表現(xiàn)為非甲基化狀態(tài)。
　　3食管鱗癌組織中RASSF5A基因的表達、甲基化狀態(tài)及其與臨床病理資料之間的關系
　　3.1食管鱗癌組織中RASSF5A基因mRNA的表達
　　RASSF5A基因mRNA在食管鱗癌和癌旁正常組織的表達量分別為0.57±0.18和0.87±0.10，食管鱗癌組織中RASSF5A基因的mRNA表達量明顯低于癌旁正常組織，兩者的差異有統(tǒng)計學意義(t=-10.201，P=0

10、.000)。在食管鱗癌患者中，RASSF5A的mRNA表達與患者的淋巴結轉(zhuǎn)移情況及腫瘤組織的分期和分化程度有關（P＜0.05），而與患者的年齡和性別無關(P＞0.05)。
　　3.2食管鱗癌組織中RASSF5A基因蛋白的表達
　　49例食管鱗癌組織中，RASSF5A蛋白表達陽性率為26.5％(13/49)，49例正常食管黏膜組織中，RASSF5A蛋白表達陽性率為75.5％(37/49)，食管鱗癌組織中RASSF5A基因蛋白表

11、達陽性率顯著低于癌旁正常組織，兩者的差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000)。在食管鱗癌中，RASSF5A蛋白表達與患者的淋巴結轉(zhuǎn)移情況和腫瘤組織的分化程度有關(P＜0.05)，而與年齡、性別以及腫瘤組織的分期無關（P＞0.05）。
　　3.3食管鱗癌組織中RASSF5A基因甲基化狀態(tài)
　　RASSF5A基因啟動子區(qū)在食管鱗癌組織和癌旁正常組織中的甲基化率分別55.1％(27/49)和28.6％(14/49)。食管鱗癌組織中RAS

12、SF5A基因啟動子區(qū)甲基化率顯著高于癌旁正常組織(P=0.011)。RASSF5A基因在食管鱗癌組織中的甲基化率與年齡、性別以及腫瘤組織分期無關（P＞0.05）。低分化鱗癌組RASSF5A基因啟動子區(qū)甲基化發(fā)生率75.9％(22/29)顯著高于高中分化鱗癌組甲基化發(fā)生率25.0％(5/20)(x2=12.377，P=0.000);RASSF5A基因啟動子區(qū)在有淋巴結轉(zhuǎn)移組的甲基化發(fā)生率80.8％(21/26)顯著高于無淋巴結轉(zhuǎn)移組的甲基

13、化發(fā)生率26.1％(6/23)(x2=14.750，P=0.000)。
　　3.4 RASSF5A基因甲基化、mRNA和蛋白表達之間的關系
　　RASSF5A蛋白表達陽性的食管鱗癌組織中，其mRNA相對表達量為0.68±0.17，RASSF5A蛋白表達陰性的食管鱗癌組織中，其mRNA相對表達量為0.52±0.16，兩者差異有統(tǒng)計學意義（t=-3.036，P=0.007）。在RASSF5A基因啟動子區(qū)甲基化陽性的食管鱗癌組織中

14、，其mRNA相對表達量為0.51±0.16，甲基化陰性的食管鱗癌組織中mRNA相對表達量為0.64±0.17，兩者差異有統(tǒng)計學意義(t=-2.737，P=0.009)。發(fā)生RASSF5A基因啟動子區(qū)高甲基化的食管鱗癌組織中RASSF5A蛋白表達陽性率為11.1％(3/27)，RASSF5A基因啟動子區(qū)甲基化陰性的食管鱗癌組織中RASSF5A蛋白表達陽性率為45.5％(10/22)，兩者差異有統(tǒng)計學意義(x2=7.335，P=0.007)

15、。RASSF5A基因啟動子區(qū)甲基化與其蛋白表達之間呈負相關(R=-0.387，P=0.006)。
　　結論:
　　1食管鱗狀上皮組織中主要表達的RASSF5的轉(zhuǎn)錄本可能是RASSF5A。
　　2甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-aza-dC能夠逆轉(zhuǎn)RASSF5A基因的甲基化，使RASSF5A恢復表達，提示RASSF5A基因啟動子區(qū)異常高甲基化可能是導致其在食管癌細胞中表達缺失的重要機制之一。
　　3食管鱗癌組織中RASSF5A