芯殼結(jié)構(gòu)電紡纖維攜載生物活性大分子的研究.pdf

1、電紡絲是一種使帶電荷聚合物溶液或熔體在靜電場(chǎng)中射流來(lái)制備聚合物超細(xì)纖維的技術(shù)，纖維直徑可控制在幾個(gè)納米到數(shù)十微米之間。電紡纖維由于具有高比表面積和類似于天然細(xì)胞外基質(zhì)的納米尺度結(jié)構(gòu)，在藥物釋放載體及組織工支架方面顯示出很大的應(yīng)用潛力。將攜載生物活性大分子的電紡纖維作為組織工程支架，在為細(xì)胞增殖和遷移提供支撐的同時(shí)，可通過(guò)釋放生物活性物質(zhì)調(diào)控細(xì)胞功能、促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)分泌以及加快組織再生。然而，由于多數(shù)生物活性物質(zhì)，例如生長(zhǎng)因子和核酸等，并

2、不具有可紡性，同時(shí)穩(wěn)定性低，因此制備攜載生長(zhǎng)因子和核酸的纖維支架就需要在制備及使用過(guò)程中有效保護(hù)其結(jié)構(gòu)與生物活性、調(diào)節(jié)其釋放行為。據(jù)此，本論文以乳液靜電紡絲技術(shù)制備具有芯殼結(jié)構(gòu)的載蛋白質(zhì)或基因纖維，研究蛋白質(zhì)或基因的釋放行為與纖維基質(zhì)材料組成以及其蛋白質(zhì)或基因在纖維中存在狀態(tài)之間的關(guān)系，以期得到可持續(xù)、可控并有效釋放蛋白質(zhì)或基因的纖維釋放體系。最后，將乳液電紡法制備的包裹堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)和其表達(dá)質(zhì)粒(pbFGF)的電紡

3、纖維膜，應(yīng)用于大鼠糖尿病皮膚損傷的治療。
　　 以溶菌酶為模型蛋白，使用乳液靜電紡絲法制備了載蛋白質(zhì)的聚乳酸(PDLLA)纖維。經(jīng)掃描電子顯微鏡、透射電子顯微鏡以及激光共聚焦微鏡觀察，纖維呈現(xiàn)芯殼結(jié)構(gòu)，溶菌酶被作為芯層包裹于聚合物纖維內(nèi)部。通過(guò)電泳、高效液相、紅外光譜、酶活檢測(cè)以及體外釋放實(shí)驗(yàn)研究表明，芯殼纖維結(jié)構(gòu)可以抑制突釋，并且在釋放過(guò)程中保護(hù)溶菌酶的結(jié)構(gòu)完整性以及生物學(xué)活性。
　　 在載溶菌酶電紡纖維中，以提高包裹

4、效率、結(jié)構(gòu)完整性和生物活性保持率為目標(biāo)，優(yōu)化了乳液電紡體系參數(shù)，如聚合物組成、水油相體積比與蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑等，溶菌酶包裹效率達(dá)94.0％，酶比活力保持率為64.6％。載溶菌酶纖維在體外釋放過(guò)程中，釋放速率受纖維結(jié)構(gòu)塌陷加速釋放、與纖維粘連減少有效釋放面積減慢釋放的競(jìng)爭(zhēng)性作用影響。以優(yōu)化參數(shù)制備的包裹量為0.46％的載溶菌酶聚乳酸-聚乙二醇嵌段共聚物(PELA-10，PEG含量為10％)纖維，在體外釋放過(guò)程中的突釋量?jī)H有近6％，且在約5周時(shí)

5、間內(nèi)持續(xù)釋放。
　　 根據(jù)糖尿病皮膚潰瘍治療時(shí)生長(zhǎng)因子的用量要求，制備包裹量為0.079±0.015％。的載bFGF電紡纖維，體外釋放中突釋量為14.0±2.2％，在25天內(nèi)釋放持續(xù)。通過(guò)細(xì)胞增殖檢測(cè)、細(xì)胞伊紅染色、分泌膠原的天狼猩紅染色和蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)，結(jié)果表明與浸潤(rùn)自由bFGF的細(xì)胞培養(yǎng)板和空白纖維膜相比，載bFGF纖維對(duì)鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)的粘附、增殖和Ⅰ型膠原分泌起到持續(xù)的促進(jìn)作用。
　　 以綠色熒光

6、蛋白表達(dá)質(zhì)粒(pEGFP-N2)為模型，分別以裸質(zhì)粒或與陽(yáng)離子聚合物聚乙烯亞胺(PEI)形成復(fù)合粒子的方式，通過(guò)乳液靜電法包裹于PELA-10纖維或PELA-10與PEI的共混纖維中。載質(zhì)?；驈?fù)合粒子的纖維具有芯殼結(jié)構(gòu)，電泳和細(xì)胞轉(zhuǎn)染結(jié)果顯示，纖維的芯核結(jié)構(gòu)能夠保護(hù)質(zhì)?；驈?fù)合粒子不被降解。攜載裸pDNA電紡纖維由于缺乏轉(zhuǎn)染載體，不能對(duì)接種于纖維膜上的細(xì)胞進(jìn)行有效轉(zhuǎn)染；以PEI和聚合物共混物作為纖維基質(zhì)材料攜載裸pDNA時(shí)，顯示出較高轉(zhuǎn)染

7、效率，但是對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)具有明顯的毒性；包裹PEI-pDNA復(fù)合粒子的電紡纖維釋放速率緩慢，但是可以有效轉(zhuǎn)染接種于纖維膜上細(xì)胞，并且對(duì)細(xì)胞的毒性較小。
　　 為調(diào)節(jié)攜載pDNA-PEI復(fù)合粒子電紡纖維中復(fù)合粒子的釋放行為，在纖維基質(zhì)材料中加入聚乙二醇(PEG)制備復(fù)合纖維。隨著PEG分子量和含量的增加，復(fù)合粒子的突釋量增加，持續(xù)釋放時(shí)間相應(yīng)減短，通過(guò)調(diào)節(jié)PEG的分子量和用量，釋放持續(xù)時(shí)間可控制在1周到1月的范圍內(nèi)。雖然加入聚合物纖

8、維的PEG改善了纖維的親疏水性，但纖維釋放的復(fù)合粒子轉(zhuǎn)染細(xì)胞對(duì)細(xì)胞的粘附與增殖都有影響。與未添加PEG電紡纖維的低轉(zhuǎn)染水平相比，含PEG電紡纖維能持續(xù)轉(zhuǎn)染細(xì)胞并表達(dá)綠色熒光蛋白。
　　 根據(jù)糖尿病皮膚潰瘍治療的時(shí)間要求，在優(yōu)化條件下制備了攜載pbFGF-PEI復(fù)合粒子的PELA和PEG復(fù)合纖維，復(fù)合粒子可以在4周內(nèi)持續(xù)釋放，接種于纖維膜上的MEF細(xì)胞持續(xù)表達(dá)bFGF。和浸潤(rùn)pbFGF復(fù)合粒子的細(xì)胞培養(yǎng)板以及空白纖維膜相比，接種于

9、包裹復(fù)合粒子纖維膜上的細(xì)胞，其增殖受轉(zhuǎn)染引起的細(xì)胞毒性、bFGF表達(dá)引起的促進(jìn)增殖的爭(zhēng)競(jìng)性影響。
　　 在建立糖尿病大鼠皮膚潰瘍模型的基礎(chǔ)上，將載bFGF電紡纖維、載pbFGF-PEI復(fù)合粒子電紡纖維分別覆蓋于糖尿病大鼠的皮膚缺損處時(shí)，研究對(duì)組織修復(fù)的促進(jìn)作用。纖維膜在創(chuàng)傷愈合中主要起三方面作用：抑菌敷料、細(xì)胞生長(zhǎng)支架以及生長(zhǎng)因子或其質(zhì)粒的釋放載體。包裹bFGF的方式可以避免組織液中蛋白水解酶對(duì)生長(zhǎng)因子的降解作用，而通過(guò)持續(xù)釋放

10、pbFGF-PEI復(fù)合粒子，可在創(chuàng)面持續(xù)表達(dá)bFGF。從新生微血管形成、細(xì)胞增殖、膠原分泌量及結(jié)構(gòu)、創(chuàng)面再上皮化速度、皮膚附屬器管生長(zhǎng)等方面分別研究了皮膚修復(fù)過(guò)程，結(jié)果表明加快了創(chuàng)面各修復(fù)階段的進(jìn)程，顯著縮短了創(chuàng)面愈合時(shí)間，新生上皮具有與正常皮膚類似的結(jié)構(gòu)特征。
　　 綜上所述，本論文首次系統(tǒng)地研究了以乳液靜電紡絲法構(gòu)建載蛋白質(zhì)或基因等生物活性大分子的芯殼結(jié)構(gòu)纖維，并成功應(yīng)用于糖尿病皮膚潰瘍的治療。通過(guò)對(duì)制備體系、釋放機(jī)制及與細(xì)