LCM與RT-PCR聯(lián)合應(yīng)用分析CDK2AP1mRNA在口腔鱗癌中的表達(dá)水平.pdf

1、口腔鱗狀細(xì)胞癌是口腔頜面部最常見的惡性腫瘤，約占口腔頜面部惡性腫瘤的80％。由于其發(fā)病部位多位于體表或接近體表而嚴(yán)重影響患者的生理功能以及社會交往。癌基因的激活與抑癌基因的失活是導(dǎo)致口腔癌的主要病因?？谇话┤笔Щ?（deletedinoralcancer-1,DOC-1）是1995年分離出的一個候選抑癌基因，人DOC-1/CDK2AP1基因位于染色體12q24，其cDNA全長1627bp,共編碼115個氨基酸,其蛋白產(chǎn)物p12CDK2

2、AP1的分子量為12.4kDa。p12CDK2AP1具有腫瘤生長抑制功能，在口腔鱗癌細(xì)胞系中表達(dá)缺失。
　　激光捕獲顯微切割（LacerCaptureMicrodissection，LCM）技術(shù)是1996年開發(fā)的顯微鏡下從組織切片中分離、純化單一類型細(xì)胞群或單個細(xì)胞的技術(shù)，可在基本不損傷細(xì)胞內(nèi)分子物質(zhì)和組織形態(tài)的情況下，從細(xì)胞群中分離出單個細(xì)胞甚至亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的技術(shù)。近年來在腫瘤分子生物學(xué)研究中廣泛應(yīng)用，可與各種基于細(xì)胞、DNA、R

3、NA及蛋白質(zhì)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)相結(jié)合，為研究結(jié)果的高精確性和可靠性提供了保證。
　　實(shí)驗(yàn)?zāi)康?br>　　本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，在不同分化程度的口腔鱗癌組織中p12CDK2AP1蛋白及DOC-1/CDK2AP1基因mRNA的表達(dá)量存在差異，但由于實(shí)驗(yàn)材料為腫瘤及正常組織的標(biāo)本塊，可能受到組織中異質(zhì)細(xì)胞的干擾而影響結(jié)果的可靠性和精確性，本實(shí)驗(yàn)研究的目的是通過LCM技術(shù)與半定量RT-PCR相結(jié)合的方法，來精確檢測DOC-1/CDK2AP1基因在

4、不同分化水平的口腔鱗癌患者的腫瘤細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞及正常細(xì)胞中的mRNA的表達(dá)含量是否有區(qū)別，為口腔鱗癌的分子診斷、治療提供依據(jù)。
　　實(shí)驗(yàn)方法
　　1.使用激光捕獲顯微切割技術(shù)（LCM）對口腔鱗癌的腫瘤細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞及正常細(xì)胞進(jìn)行純化，獲得高度純化的單一目的細(xì)胞群。
　　2.設(shè)計DOC-1/CDK2AP1基因及內(nèi)參照β-actin的特異性引物，采用半定量RT-PCR的方法檢測不同分化水平的口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中的腫瘤細(xì)胞、

5、間質(zhì)細(xì)胞和正?？谇患?xì)胞中DOC-1/CDK2AP1基因mRNA的表達(dá)情況。
　　3.PCR所得產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳后，利用凝膠成像分析系統(tǒng)測定電泳條帶的灰度值，將DOC-1/CDK2AP1與β-actin的灰度值進(jìn)行對比獲得DOC-1/CDK2AP1電泳條帶的相對灰度值，對所得相對值進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　DOC-1/CDK2AP1基因在正常細(xì)胞、腫瘤間質(zhì)細(xì)胞中的電泳條帶相對灰度值分別為1.49±0.07

6、、1.47±0.10，而在低分化、中分化、高分化口腔癌中的相對灰度值分別為0.95±0.08、1.04±0.06、1.25±0.10。統(tǒng)計分析顯示：DOC-1/CDK2AP1基因mRNA的表達(dá)水平在腫瘤組織間質(zhì)細(xì)胞與正常組織細(xì)胞中無明顯著性差異；在癌細(xì)胞中的表達(dá)水平與腫瘤組織間質(zhì)細(xì)胞、正常組織細(xì)胞中分別存在顯著性差異（P＜0.01），其表達(dá)水平顯著降低。DOC-1/CDK2AP1基因mRNA在高分化鱗癌中的表達(dá)水平高于在中分化鱗癌中的表

7、達(dá)水平，存在顯著性差異（P＜0.01）；高分化鱗癌中的表達(dá)水平高于在低分化鱗癌中的表達(dá)水平，存在顯著性差異（P＜0.01）；、DOC-1/CDK2AP1基因mRNA在中分化鱗癌中的表達(dá)水平均數(shù)高于在低分化鱗癌中的表達(dá)水平均數(shù)，無顯著性差異（P＞0.05）。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)論
　　本實(shí)驗(yàn)證實(shí)DOC-1/CDK2AP1基因mRNA在口腔鱗癌中表達(dá)下調(diào)，與腫瘤的惡性程度有一定相關(guān)性，中低分化鱗癌中的表達(dá)水平低于高分化鱗癌，中低分化鱗癌