microRNA-126在乳腺癌紫杉醇化療耐藥中的作用.pdf

1、研究背景：
　　當(dāng)前在全世界范圍內(nèi)，乳腺癌已經(jīng)成為女性最常見且死亡率最高的癌癥。在我國，由于經(jīng)濟(jì)發(fā)展，人民生活習(xí)慣的不斷西化，人口的老齡化也越來越明顯，種種的原因?qū)е铝巳橄俚陌l(fā)病率和死亡率正在迅速攀升。目前手術(shù)仍是乳腺癌的首選治療方式，且手術(shù)方式也在不斷的改進(jìn)。但是現(xiàn)在越來越多的學(xué)者達(dá)成共識(shí)，認(rèn)為乳腺癌并不只是單純一個(gè)組織的病變而是一種全身的系統(tǒng)性疾病，其發(fā)生發(fā)展涉及到很長的一個(gè)生命過程。于是，現(xiàn)在普遍認(rèn)為乳腺癌的治療需要多種治療

2、手段相配合，各科室間相互合作，既要保證規(guī)范化同時(shí)還要達(dá)到個(gè)體化?；熢谌橄侔┑木C合治療中發(fā)揮著不可替代的作用，其中紫杉類藥物是目前最常用的化療藥物。但是就像大多數(shù)抗腫瘤藥一樣，耐藥性的產(chǎn)生是影響其臨床療效的巨大障礙。因此，對(duì)化療藥物耐藥機(jī)制的研究是非常重要的。術(shù)前預(yù)測(cè)患者對(duì)特定藥物的化療敏感性或逆轉(zhuǎn)其耐藥性將會(huì)是未來提高惡性腫瘤治療效果的重關(guān)鍵突破點(diǎn)。近年來，隨著microRNA（miRNA）研究的不斷深化，關(guān)于miRNA參與調(diào)控腫瘤細(xì)

3、胞各種生命進(jìn)程的證據(jù)越來越多。在一些最新的研究中，學(xué)者發(fā)現(xiàn)miRNA與腫瘤細(xì)胞耐藥性的改變高度相關(guān)。本研究通過高通量測(cè)序技術(shù)篩選出在紫杉醇耐藥患者和敏感患者之間差異表達(dá)的miRNA，并以miR-126為最終研究對(duì)象，使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR在組織水平進(jìn)行驗(yàn)證，采用外源RNA干擾技術(shù)調(diào)節(jié)miR-126在乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)水平，觀察并分析其表達(dá)量的改變對(duì)乳腺癌紫杉醇化療耐藥的影響及其可能作用機(jī)制。
　　目的：
　　探討微小RNA-

4、126(miR-126)對(duì)乳腺癌紫杉醇化療耐藥性產(chǎn)生的作用及潛在機(jī)制。
　　方法：
　　采用高通量分析技術(shù)篩選出在乳腺癌紫杉醇耐藥組織和敏感組織中差異表達(dá)的miRNA，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(Real-time PCR)進(jìn)行驗(yàn)證。經(jīng)通過RNA干擾技術(shù)人為調(diào)整miR-126在MCF-7及紫杉醇耐藥的MCF-7/TAX細(xì)胞中的表達(dá)水平，CCK8檢測(cè)干擾前后腫瘤細(xì)胞在不同濃度紫杉醇作用下的存活率，計(jì)算出半數(shù)抑制濃度(IC50)，用

5、在線預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)miR-126潛在的靶基因，免疫印跡法檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞內(nèi)Snai2蛋白的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　1、高通量測(cè)序分析并篩選出了紫杉醇耐藥組織和敏感組織間差異性表達(dá)的miRNA，選擇miR-126為最終研究對(duì)象。
　　2、熒光定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-126在耐藥組患者癌組織中的相對(duì)表達(dá)量為0.04±0.01，在敏感組為1.08±0.41，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。
　　3、熒光定量

6、PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-126在常規(guī)培養(yǎng)的MCF-7/TAX細(xì)胞株中的表達(dá)水平較MCF-7細(xì)胞有明顯的下降(P＜0.001)。
　　4、以Lipo2000為載體，用miR-126 mimics、miR-126 inhibitor及相應(yīng)的陰性對(duì)照(negative control，NC)分別轉(zhuǎn)染MCF-7/TAX細(xì)胞和MCF-7細(xì)胞后予不同濃度紫衫處理。CCK-8法檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)miR-126 mimics轉(zhuǎn)染的MCF-7/TAXOL

7、細(xì)胞較陰性對(duì)照組的敏感性明顯增強(qiáng)，而對(duì)于轉(zhuǎn)染miR-126 inhibitor的MCF-7細(xì)胞來說，其紫杉醇敏感性較相應(yīng)的陰性對(duì)照組有明顯降低。根據(jù)以上結(jié)果計(jì)算出各組對(duì)紫杉醇的IC50，可以發(fā)現(xiàn)MCF-7/TAX mimics組的IC50明顯低于相應(yīng)對(duì)照組:(4.68±0.32ug/ml) vs(14.95±0.43ug/ml),P＜0.01;而MCF-7 inhibitor組的IC50則較相應(yīng)對(duì)照組大幅升高:(12.18±0.81 u

8、g/ml) vs(2.15±0.35 ug/ml)，P＜0.01。
　　5、通過RNAhybrid、PITA、miRanda、PicTar及RNAfold預(yù)測(cè)軟件篩選出24個(gè)miR-126的潛在靶基因。
　　6、免疫印跡檢測(cè)結(jié)過顯示MCF-7細(xì)胞在轉(zhuǎn)染miR-126 inhibitor后，Snai2蛋白的表達(dá)水平較陰性對(duì)照組明顯升高，兩者的相對(duì)表達(dá)量分別為:0.70±0.02和0.40±0.01,P＜0.01;另一方面，用m

9、iR-126 mimics或陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染MCF-7/TAXOL細(xì)胞72小時(shí)后，檢測(cè)到Snai2蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為0.09±0.02和0.63±0.01，P＜0.01。
　　結(jié)論：
　　1、miR-126的表達(dá)水平和乳腺癌對(duì)紫杉醇化療的敏感性密切相關(guān)。降低miR-126在MCF-7細(xì)胞中的表達(dá)水平可使其獲得一定的耐藥性，而提高miR-126在MCF-7/TAX細(xì)胞中的表達(dá)水平可以逆轉(zhuǎn)耐藥。
　　2、miR-126對(duì)乳