蘆筍質(zhì)量控制的現(xiàn)代分析方法研究.pdf

1、蘆筍是百合科天門冬屬植物，是世界十大名菜之一，味道鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富，并具有很好的保健功效。研究表明，蘆筍具有多種藥理活性，如抗腫瘤、降血脂、增強(qiáng)免疫力、抗衰老、抗疲勞和保護(hù)肝臟等。目前，對(duì)蘆筍化學(xué)成分的研究較少，僅停留在總黃酮和總皂苷的初步分離純化上，因此，尚無法對(duì)蘆筍進(jìn)行全面有效的質(zhì)量控制。本論文首先對(duì)蘆筍的營(yíng)養(yǎng)成分進(jìn)行了較為全面的質(zhì)量控制，然后對(duì)蘆筍中的化學(xué)成分進(jìn)行分離鑒定，并對(duì)蘆筍黃酮部位進(jìn)行富集純化并作定量分析，再通過二維柱切換液

2、相色譜法分離制備了蘆筍中五種黃酮苷，并采用全二維液相色譜法對(duì)蘆筍黃酮部位進(jìn)行了分析，考察了各成分與脂質(zhì)體膜之間的相互作用，最后對(duì)所得五種黃酮苷和蘆筍黃酮部位進(jìn)行了體外抗氧化活性研究，初步揭示并驗(yàn)證了蘆筍發(fā)揮藥理活性的物質(zhì)基礎(chǔ)和黃酮抗氧化活性的構(gòu)效關(guān)系。 一、蘆筍中營(yíng)養(yǎng)成分的質(zhì)量控制 1、氨基酸在pH5.5時(shí)與茚三酮反應(yīng)形成藍(lán)紫色化合物，顏色的深淺與溶液中氨基酸的含量成正比，且在570nm處有最大吸收，利用此原理，測(cè)定該波

3、長(zhǎng)處的吸光度即可計(jì)算氨基酸濃度。本實(shí)驗(yàn)以L-谷氨酸為標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)方法學(xué)進(jìn)行了全面考察，線性回歸方程為A=0.0073C-0.1133(r=0.9998)，線性范圍30.30-151.50μg/mL，樣品經(jīng)顯色反應(yīng)后在1.5h小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定，精密度、重現(xiàn)性和回收率結(jié)果均符合要求。十批不同來源的鮮蘆筍樣品中總游離氨基酸含量為17.43-22.43‰。 2、考馬斯亮藍(lán)G-250在游離狀態(tài)下呈紅色，在稀酸中與蛋白質(zhì)結(jié)合變成藍(lán)色，最大吸收波長(zhǎng)也從

4、465nm變成595nm，蛋白質(zhì)與考馬斯亮藍(lán)G-250結(jié)合物在595nm波長(zhǎng)下的吸光度與蛋白質(zhì)含量成正比，因此，可以根據(jù)此原理測(cè)定蛋白質(zhì)含量。本實(shí)驗(yàn)以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)方法學(xué)進(jìn)行了全面的考察，線性回歸方程為A=0.0077C+0.0524(r=0.9996)，線性范圍19.80-99.00μg/mL，樣品經(jīng)顯色反應(yīng)后在1.5h小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定，精密度、重現(xiàn)性和回收率結(jié)果均符合要求。十批不同來源的鮮蘆筍樣品中總蛋白質(zhì)含量為1.08-1.69

5、‰。 3、蘆筍中總多糖的含量測(cè)定采用的是硫酸葸酮顯色法，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，線性方程為A=0.0081C+0.0907(r=0.9990)，線性范圍20.00-100.00μg/mL，樣品經(jīng)顯色反應(yīng)后在1.5h小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定，精密度、重現(xiàn)性和回收率結(jié)果均符合要求。十批不同來源的干燥蘆筍樣品中總多糖含量為1.16-1.64％。 4、選擇AOC為衍生化試劑，以普通C18柱作為分離載體，建立了蘆筍水解氨基酸的指紋圖譜，確定了16個(gè)共

6、有峰，鑒定了其中的11個(gè)氨基酸，并在指紋圖譜條件的基礎(chǔ)上測(cè)定了10批蘆筍中11種氨基酸的含量，結(jié)果如下：組氨酸2.97-5.56％0，甘氨酸0.39-0.53％0，天冬氨酸1.64-3.63％0，谷氨酸0.89-1.55‰，蘇氨酸0.32-0.46％0，丙氨酸0.32-0.57％0，胱氨酸0.47-1.01‰，酪氨酸0.23-0.28‰，纈氨酸0.36-0.65‰，亮氨酸0.37-0.60‰，苯丙氨酸0.35-0.44％0。 二

7、、蘆筍的化學(xué)成分研究 1、蘆筍中兩種嘌呤類化合物的分離制備 干燥蘆筍藥材的60％乙醇回流提取液濃縮后過大孔吸附樹脂柱，收集20％乙醇洗脫流分，再經(jīng)葡聚糖凝膠柱脫色，純化后的樣品采用制備液相色譜法分離，得到兩種嘌呤類化合物，經(jīng)1HNMR和13CNMR鑒定為9-(2-甲硫基-3-磺酸基-4-羥基)-呋喃-6-氨基-嘌呤和腺苷。 2、蘆筍中五個(gè)黃酮類化合物的分離制備 干燥蘆筍藥材的60％乙醇回流提取液濃縮后過大

8、孔吸附樹脂柱，收集40％乙醇洗脫流分，再經(jīng)葡聚糖凝膠柱脫色，純化后的樣品采用制備液相色譜法分離，得到五種黃酮苷，經(jīng)HPLC-DAD-MS鑒定為槲皮素-3-O-葡萄糖-蕓香糖苷、蘆丁、異鼠李素-3-O-葡萄糖.蕓香糖苷、煙花苷和水仙苷。 3、蘆筍中一種有機(jī)酸的分離制備 干燥蘆筍藥材的60％乙醇回流提取液濃縮后過大孔吸附樹脂柱，收集60％乙醇洗脫流分，再經(jīng)葡聚糖凝膠柱純化，即得純品，經(jīng)1HNMR和13CNMR鑒定為肉桂酸。

9、 三、蘆筍黃酮部位的制備與定量分析 1、干燥蘆筍藥材的60％乙醇回流提取液濃縮后過大孔吸附樹脂柱(60×4cm)，先靜止吸附1h，再分別用水1500mL、20％乙醇2000mL和40％乙醇2000mL依次洗脫。收集40％乙醇部分并于50℃減壓濃縮至干，加30％甲醇溶解后，過Sephadex LH-20型葡聚糖凝膠柱(100×3cm)，分別用300mL水、200mL50％甲醇和1000mL甲醇依次洗脫，收集含黃酮的流分，合并

10、后于50℃減壓濃縮至干，即得蘆筍黃酮部位。 2、采用紫外分光光度法，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，測(cè)定了蘆筍黃酮部位中總黃酮含量，并對(duì)方法學(xué)作了詳細(xì)考察，線性回歸方程為A=0.0024C-0.0174(r=0.9992)，線性范圍62.00-310.00μg/mL，樣品經(jīng)顯色反應(yīng)后在1.5h小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定，精密度、重現(xiàn)性和回收率結(jié)果均符合要求。所測(cè)三批樣品中總黃酮的含量均高于50％。 3、采用高效液相色譜法測(cè)定了蘆筍黃酮部位中槲皮素-3-

11、O-葡萄糖-蕓香糖苷、蘆丁、異鼠李素-3-O-葡萄糖-蕓香糖苷、煙花苷和水仙苷的含量，色譜條件如下：色譜柱為Diamonsil(R)(鉆石)C18柱(200×4.6mm，5μm)(DikmaTechnologies)，流動(dòng)相：乙腈-甲醇-0.1％醋酸水(8：16：76)，流速1.0 mL/min，柱溫30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)260nm，進(jìn)樣量20μL，方法學(xué)考察結(jié)果符合要求。測(cè)定三批樣品中槲皮素-3-O-葡萄糖-蕓香糖苷、蘆丁、異鼠李素-3-O

12、-葡萄糖-蕓香糖苷、煙花苷和水仙苷的含量分別為11.26-12.62％，22.64-24.78％，4.37-5.09％，4.13-4.89％，3.22-3.63％。 四、蘆筍中黃酮苷單體的二維色譜法制備及蘆筍黃酮部位的全二維液相色譜分析 1、采用二維柱切換液相色譜分離制備了蘆筍中五種黃酮苷單體(槲皮素-3-O-葡萄糖-蕓香糖苷、蘆丁、異鼠李素-3-O-葡萄糖-蕓香糖苷、煙花苷和水仙苷)，該系統(tǒng)維間切換沒有用到定量環(huán)，而是

13、用六通切換閥取而代之，這樣可以確保組分被全部切換進(jìn)入第二維，避免了樣品損失，且切換體積不受定量環(huán)限制。與普通的一維制備液相色譜法相比，該法可以大大提高分離效率，并節(jié)約有機(jī)溶劑用量。 2、采用HSCCC-PHPLC二維方法從蘆筍黃酮粗品中分離制備了五個(gè)黃酮苷單體(槲皮素-3-O-葡萄糖-蕓香糖苷、蘆丁、異鼠李素-3-O-葡萄糖-蕓香糖苷、煙花苷和水仙苷)。該方法中，HSCCC作為一種預(yù)處理手段，分離得到兩個(gè)含目標(biāo)成分的流分，繼而通

14、過制備液相色譜進(jìn)一步分離得到高純度的目標(biāo)化合物。該法避免了繁瑣的樣品柱色譜預(yù)處理過程，具有操作簡(jiǎn)便、制備效率高等優(yōu)點(diǎn)。 3、采用全二維液相色譜法分析了蘆筍黃酮部位，第一維采用的是脂質(zhì)體柱(250×4.6mm，5μm，自制)，流動(dòng)相為10mmol/L，pH7.4的醋酸銨緩沖液，流速0.1mL/min：第二維采用Chromolith Performance RP-18e(100×4.6mm)整體柱，流動(dòng)相采用A：乙腈，B：10％乙腈

15、梯度洗脫，0-2min3％A，2-4min3％A-17％A，4-4.5min，17％A-3％A，4.5-5.0min，3％A，流速3.0 mL/min。通過考察蘆筍中不同成分在脂質(zhì)體柱上的色譜行為，可以判斷各成分與脂質(zhì)體膜之間的相互作用強(qiáng)弱，從而推斷藥物在生物體內(nèi)的ADME。 五、蘆筍總黃酮及其黃酮苷單體體外抗氧化活性研究 以VitC為陽性對(duì)照藥物，系統(tǒng)研究了蘆筍總黃酮及其黃酮苷單體的體外抗氧化活性。結(jié)果表明，蘆筍中的黃

16、酮苷單體有較強(qiáng)的抗氧化活性：能明顯清除·OH和D2-，對(duì)DPPH自由基也有較強(qiáng)的清楚作用，具有較強(qiáng)的抑制大鼠紅細(xì)胞氧化溶血的作用。蘆筍總黃酮也有相應(yīng)的體外抗氧化活性，強(qiáng)度與總黃酮含量相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證并揭示了蘆筍發(fā)揮多種藥理活性的物質(zhì)基礎(chǔ)和黃酮類化合物抗氧化活性的構(gòu)效關(guān)系。 綜上所述，本論文以蘆筍的質(zhì)量控制為目的，建立了總游離氨基酸、總蛋白質(zhì)和總多糖三大營(yíng)養(yǎng)成分的定量分析方法，建立了蘆筍水解氨基酸的指紋圖譜并對(duì)其中11種氨基酸作了

17、定量分析。為了進(jìn)一步了解蘆筍發(fā)揮藥理活性的物質(zhì)基礎(chǔ)，本論文對(duì)蘆筍的化學(xué)成分作了初步研究，首次從蘆筍中分離出兩種嘌呤類化合物、五種黃酮苷和一種有機(jī)酸。建立了蘆筍黃酮部位的制備方法和定量分析方法，為今后進(jìn)一步開發(fā)蘆筍黃酮打下了基礎(chǔ)。本論文還建立了蘆筍中五種黃酮苷的二維柱切換液相色譜制備方法和HSCCC-PHPLC二維制備方法，與傳統(tǒng)制備液相色譜法相比，這兩種方法具有制備效率高、溶劑消耗少等優(yōu)點(diǎn)。本論文采用全二維液相色譜法分離分析了蘆筍黃酮部