轉(zhuǎn)錄因子KLF2對血管生成的影響及其在肝硬化門脈高壓中的參與機制.pdf

1、背景和目的:
　　轉(zhuǎn)錄因子KLF2是一種重要的抑制性血管保護因子，可通過多種途徑抑制血管內(nèi)皮生長因子介導(dǎo)的血管生成反應(yīng)，維持血流動力學(xué)穩(wěn)定。目前已發(fā)現(xiàn)血管生成在肝硬化門脈高壓(Portal Hypertention，PHT)中發(fā)揮重要作用，不僅影響肝內(nèi)血管重構(gòu)，而且促進門脈側(cè)支血管生成，引起PHT的不斷進展。因此，KLF2對改善門脈壓力有重要意義。目前關(guān)于KLF2在PHT及肝臟細胞中的研究甚少。已有研究表明，肝硬化時的內(nèi)皮細胞表型

2、部分是由血管保護因子的刺激調(diào)控的。他汀類藥物(statins)作為KLF2的誘導(dǎo)劑，可以引起下游舒血管因子的產(chǎn)量升高，降低門脈壓力。還有研究表示，PHT的動物模型中，KLF2的表達上調(diào)。但是，關(guān)于KLF2在肝硬化PHT中的作用機制還未明確，KLF2對肝內(nèi)及肝外血管生成的調(diào)控，與HIF-1α、NF-κB的關(guān)系等，還需要更多的實驗進一步證明。本研究的目的是通過對PHT病人及動物模型組織學(xué)及血清學(xué)標本的檢測，篩選與KLF2升高相關(guān)的蛋白因子，

3、以此為依據(jù)研究KLF2調(diào)控血管生成的機制及信號通路，明確他汀類藥物上調(diào)KLF2表達并改善肝星狀細胞活化的作用機理，探討KLF2對病理性血管生成的作用及機制。
　　材料和方法:
　　(1)采集肝硬化PHT行脾切除斷流手術(shù)病人的門脈系統(tǒng)血管組織，以肝功能正常因膽結(jié)石行膽囊切除術(shù)病人的腸系膜血管組織作為對照組。收集病人的血清標本。分別建立CCL4、門脈縮窄(Portal Vein Ligation，PVL)、膽總管結(jié)扎(Bile

4、Duct Ligation，BDL)三種PHT的動物模型，并收集肝臟、十二指腸、門脈血管組織及脾腎靜脈分支血管(Splenorenal shunt，SRS)組織標本。利用免疫組化、PCR以及western blot技術(shù)檢測人和動物模型的組織標本中VEGF、HIF-1α及KLF2的mnRNA和口蛋白表達水平，ELISA檢測血清標本中VEGF, IL-8及PLGF分泌因子的表達水平。
　　(2)體外，對人肝星狀細胞予以TGF-β因子刺

5、激促進其活化程度，同時用他汀類藥物上調(diào)KLF2的表達，transwell細胞遷移實驗、細胞劃痕實驗、Brdu增殖實驗、PCR、western、ELISA檢測星狀細胞的活化能力及促血管生成信號通路中相關(guān)因子的變化。
　　(3)對人臍靜脈內(nèi)皮細胞予以缺氧刺激，同時應(yīng)用慢病毒KLF2過表達顆粒轉(zhuǎn)染內(nèi)皮細胞，通過血管生成實驗、transwell遷移實驗、MTT增殖實驗、westernblot、細胞免疫熒光技術(shù)檢測細胞的成血管相關(guān)改變，從而

6、確定KLF2對內(nèi)皮血管生成的作用。
　　結(jié)果:
　　(1) PHT時血管生成及KLF2表達情況:PHT病人的腸系膜血管組織中，VEGF及KLF2蛋白的表達升高。血清標本中，VEGF、PLGF、IL-8分泌因子的表達無明顯變化。三種動物模型結(jié)果顯示，VEGF在肝、腸及血管組織中高表達;HIF-1α在肝臟及小腸組織中表達升高，而在脾腎靜脈分支血管組織中表達降低。與之對應(yīng)，KLF2在小腸中表達升高，在肝臟中表達無明顯變化。

7、　　(2)10ng/ml TGF-β刺激的HSC和對照組比較，細胞增殖效率增長1.2倍;遷移效率增長3倍;a-SMA的表達升高了大約兩倍。同時，KLF2的表達明顯上升。伴隨KLF2的表達升高，KLF2的下游靶蛋白一氧化氮合酶(eNOS)升高;核因子(NF-κB)、缺氧誘導(dǎo)因子(HIF-1α)降低;HSC分泌干擾素(INF-Γ)增加。而聯(lián)合給予1uM的辛伐他汀后，HSC細胞的遷移和增殖效率降低了50％; a-SMA的表達有所降低;HSC細

8、胞中KLF2的表達增加了約4倍，eNOS表達有所下降;INF-Γ的分泌減少，以上差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　(3) KLF2對臍靜脈內(nèi)皮細胞成血管的影響:缺氧刺激之后，對照組的臍靜脈內(nèi)皮細胞血管生成速率，增值及遷移速率增高，而KLF2過表達的細胞中，上述細胞活化效應(yīng)均明顯降低;同時，缺氧刺激可上調(diào)HIF-1α及NF-κB的表達，而KLF2可抑制其表達;KLF2下游促血管因子也有所下調(diào)，eNOS血管保護因子顯著上調(diào)。
　　結(jié)論:<

9、br>　　(1)在肝硬化PHT的病人及大鼠模型中，VEGF、HIF-1α等促血管生成因子的mRNA及蛋白的表達升高，與此同時，KLF2的表達升高。表明PHT患者體內(nèi)促血管生成反應(yīng)較對照組升高，并且可能和KLF2有關(guān)。
　　(2)他汀類藥物通過上調(diào)KLF2的表達，可抑制炎癥刺激的肝星狀細胞活化及成血管趨勢，并抑制下游的促血管因子的表達，從而抑制星狀細胞的促血管微環(huán)境。
　　(3)臍靜脈內(nèi)皮細胞過表達KLF2后，缺氧刺激導(dǎo)致的促