大鼠戊四唑點(diǎn)燃癲癇模型認(rèn)知障礙形成的內(nèi)在機(jī)制以及草果知母湯的干預(yù)作用.pdf

1、目的：人類的認(rèn)知功能涉及學(xué)習(xí)能力、記憶力、注意力及智力等方面，彼此關(guān)系密切，互有影響。癲癇因其病程長、難根治、病因復(fù)雜、發(fā)病機(jī)理不明確，是中醫(yī)常見疑難病證之一，亦被西醫(yī)學(xué)列為現(xiàn)代難治病。該病具有反復(fù)發(fā)作的特點(diǎn)，長期發(fā)作對高級神經(jīng)機(jī)能損害作用較大，尤其可致智力障礙。癲癇患者的智力障礙，主要取決于腦損害程度，表現(xiàn)為認(rèn)知功能的損害，包括記憶受損、智能下降以及注意力的障礙等。近年來，隨著醫(yī)學(xué)的發(fā)展，臨床研究發(fā)現(xiàn)，癲癇的發(fā)作類型和常規(guī)抗癲癇藥均可

2、對癲癇患者的認(rèn)知功能造成損害，并且發(fā)作的頻率、類型越嚴(yán)重，用藥的劑量越大，認(rèn)知功能的損害程度越重。由于癲癇患者往往存在發(fā)作和用藥并存的情況，目前的研究不能就癲癇發(fā)作和抗癲癇藥在認(rèn)知損害中的作用做出確切的評價(jià)，本實(shí)驗(yàn)旨在用實(shí)驗(yàn)研究的方法，利用動(dòng)物模型，模擬臨床以上兩種致病因素并進(jìn)行嚴(yán)格控制，從而準(zhǔn)確評價(jià)癲癇患者認(rèn)知障礙形成因素的作用，從而指導(dǎo)醫(yī)生和患者對其最嚴(yán)重的引發(fā)因素做出選擇性回避。 目前尚無專門針對改善癲癇患者認(rèn)知障礙的藥物

3、。由于中藥復(fù)方不同性質(zhì)藥味的配伍，使其能發(fā)揮多環(huán)節(jié)的整合、調(diào)節(jié)作用，因此，在認(rèn)知障礙的治療領(lǐng)域有獨(dú)特的優(yōu)勢，其療效和挖掘余地遠(yuǎn)遠(yuǎn)的大于化學(xué)藥物。草果知母湯源自吳鞠通《溫病條辨》，是王洪圖教授以“脾胃主神志”、“脾胃轉(zhuǎn)樞為五臟藏神關(guān)鍵”理論為指導(dǎo)，從調(diào)理脾胃入手，治療癲癇的經(jīng)方驗(yàn)方。在既往大量的臨床和實(shí)驗(yàn)研究中，我們發(fā)現(xiàn)，草果知母湯對癲癇患者和動(dòng)物的認(rèn)知功能亦有明顯的改善作用，可以明顯提高患兒的學(xué)習(xí)成績以及癲癇動(dòng)物模型的空間記憶力。本實(shí)驗(yàn)

4、旨在通過實(shí)驗(yàn)的方法，近一步確定草果知母湯改善由于驚厥反復(fù)發(fā)作與大劑量苯妥英鈉應(yīng)用導(dǎo)致大鼠認(rèn)知障礙的療效作用，并闡明草果知母湯阻斷認(rèn)知障礙形成的內(nèi)在機(jī)理。 方法：(1)利用戊四唑(pentylenetrazol，PTZ)點(diǎn)燃癲癇模型大鼠，分別施以反復(fù)點(diǎn)燃誘發(fā)驚厥高頻發(fā)作和大劑量苯妥英鈉灌胃，通過學(xué)習(xí)、記憶等行為測試，評價(jià)二者導(dǎo)致認(rèn)知損傷程度的不同；觀察以上兩種因素所導(dǎo)致的認(rèn)知損傷的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)海馬的病理形態(tài)學(xué)變化；用免疫組化法測定與認(rèn)

5、知活動(dòng)關(guān)系最密切的中樞認(rèn)知基因cAMP反應(yīng)單元結(jié)合蛋白(cAMPresponseelement-bindingprotein，pCREB)和即刻早期基因c-fos表達(dá)的不同，以闡明二者發(fā)生機(jī)制的差異。(2)觀察草果知母湯阻斷由于驚厥反復(fù)發(fā)作與大劑量苯妥英鈉導(dǎo)致大鼠認(rèn)知障礙在行為學(xué)、形態(tài)學(xué)上的改變，以闡明草果知母湯對其認(rèn)知行為的改善作用的內(nèi)在機(jī)理。 結(jié)果：(1)實(shí)驗(yàn)一部分分別使用PTZ反復(fù)誘導(dǎo)點(diǎn)燃和大劑量抗癲癇一線藥物苯妥英鈉兩種

6、方法處理后的大鼠，用Morris水迷宮來檢測其空間學(xué)習(xí)記憶成績的變化，發(fā)現(xiàn)每日發(fā)作組和苯妥英鈉大劑量組同PTZ模型組比較學(xué)習(xí)能力下降較大，故作為障礙模型組篩選出來。單從水迷宮的行為學(xué)檢測結(jié)果來看，每日發(fā)作組大鼠的認(rèn)知損害程度最大，苯妥英鈉大劑量組次之，隔日發(fā)作組再次，苯妥英鈉小劑量組最小。 (2)實(shí)驗(yàn)二中，用免疫組化和Westernblotting方法觀察經(jīng)過實(shí)驗(yàn)一處理后的大鼠海馬結(jié)構(gòu)中，與認(rèn)知功能有密切關(guān)系的兩種蛋白，即磷酸化

7、的c-AMP反應(yīng)單元結(jié)合蛋白(phosphorylatedc-AMPresponseelement-bindingprotein，pCREB)和c-fos蛋白的表達(dá)，隨著癲癇發(fā)作頻率的增加和抗癲癇藥物劑量的增大，pCREB在大鼠海馬中有下降的趨勢，并且其含量與癲癇發(fā)作頻率和抗癲癇藥物劑量成反比；c-fos蛋白在大鼠海馬中有增高的趨勢，并且其含量與癲癇發(fā)作頻率和抗癲癇藥物劑量成正比。各組間經(jīng)過比較，癲癇反復(fù)發(fā)作組和苯妥英鈉劑量組與正常組比

8、較變化顯著，從分子機(jī)制角度說明了這兩種處理方法確實(shí)對大鼠的認(rèn)知功能造成了損害。從pCREB和c-fos蛋白表達(dá)檢測結(jié)果來看，每日發(fā)作組大鼠的認(rèn)知損害程度最大，苯妥英鈉大劑量組次之，隔日發(fā)作組再次，苯妥英鈉小劑量組最小，提示癲癇高頻發(fā)作較單純抗癲癇藥物對大鼠認(rèn)知功能的損害作用更大，這與實(shí)驗(yàn)一部分中動(dòng)物行為學(xué)檢測結(jié)果相吻合。 (3)在實(shí)驗(yàn)三中，通過一段時(shí)間藥物治療后的實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，大鼠海馬部位的pCREB有上調(diào)的趨勢，并且c-fos

9、蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，提示草果知母湯對于由PTZ反復(fù)誘發(fā)導(dǎo)致的認(rèn)知障礙和由大劑量抗癲癇藥物引起的認(rèn)知障礙均有一定的反轉(zhuǎn)作用。但與對照西藥尼莫地平比較，兩者的差別未能顯現(xiàn)。 結(jié)論：癲癇高頻率發(fā)作和抗癲癇藥物均可對大鼠認(rèn)知功能造成損害影響，并且損害程度隨癲癇發(fā)作頻率的增高和抗癲癇藥物的劑量的增大而加重。比較這兩種影響大鼠認(rèn)知功能的因素，癲癇高頻發(fā)作較單純抗癲癇藥物的損害作用更大。草果知母湯確實(shí)能夠緩解在癲癇發(fā)作和治療過程種出現(xiàn)的認(rèn)知損害