足底皮膚軟組織支架的構建及其組織誘導功能的培育.pdf

1、足是人體的一個重要器官，足底皮膚軟組織的缺損在足部創(chuàng)傷中較為常見，其中燒傷、機械創(chuàng)傷以及慢性疾病導致的潰瘍（如糖尿病）是造成足底皮膚軟組織缺損及功能喪失的主要原因。
　　 從組織學結構上看，足底皮膚軟組織和人體其他部位的皮膚軟組織存在一定的差異。足底皮膚致密，具有較厚的角質(zhì)層，皮下組織結實并有脂肪墊，可緩沖足底壓力對神經(jīng)和血管的壓迫。足底皮膚組織中有垂直走形的纖維與足底肌肉的腱膜相連，可有效地限制皮膚過度移動，形成“皮膚連接”。

2、同時，足底皮膚組織中的脂肪墊內(nèi)充滿了散在的細小而強韌的結締組織纖維束，可固定皮膚，限制脂肪移位，它們的排列方向與承受的主要壓力方向相適應。因此，足底皮膚具有耐磨、耐壓、承重的功能，并且有不打滑和不同部位厚度不同的特點，有利于行走和負重時的穩(wěn)定。
　　 目前國內(nèi)、外對足底皮膚軟組織缺損主要是通過皮瓣移植來進行修復。大量的國內(nèi)外文獻報道了皮瓣供區(qū)的選擇、血供的恢復、感覺的建立等方面的研究。而這些研究，都是利用患者的健康部位來修復足底

3、皮膚軟組織的缺損，雖然對足底皮膚的感覺恢復、足底厚度及耐磨耐壓方面有一定改善，但是移植皮瓣（除足底內(nèi)、外側(cè)皮瓣）愈合后缺少足底皮膚組織中特有的“皮膚連接”結構，造成移植修復后足底皮膚出現(xiàn)反復潰瘍和移植皮瓣在行走負重時出現(xiàn)的“足底打滑”現(xiàn)象，至今沒有很好的解決辦法。另外對供區(qū)造成了人為的二次損傷，這種以“創(chuàng)傷修復創(chuàng)傷”的治療模式必然會被組織工程學的“無損傷修復創(chuàng)傷”的新認識所取代。
　　 國外從1975年開始，由Rheinwald

4、和Green首先實現(xiàn)了表皮細胞的體外大量擴增，并于1979年獲得了完整的表皮細胞膜片，使表皮層的移植成為可能。1981年，O'Connor首次成功地實現(xiàn)了體外培植的自體表皮細胞膜片在皮膚創(chuàng)面的移植。在上世紀80年代初由Burke和Yannas等研制成功無細胞型組織工程化真皮并于1996年成為商品化的產(chǎn)品—Integra(Integralifesciences)，獲得了美國FDA臨床使用的許可。由Advancedtissuescience

5、s公司生產(chǎn)的細胞復合型組織工程真皮Dermagraft治療慢性糖尿病患者足部潰瘍的愈合速度明顯快于傳統(tǒng)的覆蓋物。
　　 在我國，皮膚組織工程的研究也逐漸引起人們的重視，高等院校、科研院所與醫(yī)療機構也相繼在組織工程化人工皮膚方面進行了大膽嘗試與探索，取得了積極的成果。曹誼林等以聚乙交酯為主要材料，復合患者自體細胞，研制了一種組織工程化皮膚。馬建標等用殼聚糖作為主要材料，開發(fā)了能促進人成纖維細胞生長的海綿狀人工真皮。第四軍醫(yī)大的金巖

6、等利用人成纖維細胞和表皮細胞在膠原凝膠中的復合種植，成功構建了一種類似Apligraf的組織工程雙層皮膚替代物，并取得了國家食品藥品監(jiān)督管理局(SFDA)的臨床使用許可。此外，夏照帆的脫細胞真皮支架、蘇州大學蠶絲蛋白構建皮膚再生產(chǎn)品的研究都具有一定的特色。但是迄今為止，具有組織誘導再生特性的皮膚再生產(chǎn)品多處于實驗室研究階段。
　　 雖然國內(nèi)外學者利用組織工程學原理構建了人體皮膚替代物來解決皮膚缺損這一類問題，并取得了突破性進展，

7、積累了有關皮膚組織工程方面的大量基礎性數(shù)據(jù)。但是，在對足底皮膚軟組織缺損的組織工程化修復方面的研究報道還很少。
　　 本課題通過組織工程學的原理重新構建足底皮膚軟組織。首先，通過顯微技術、電鏡掃描等技術分析足底纖維的結構特征，了解足底的生物力學性能。在此基礎上，利用天然無毒高分子聚合物構建足底皮膚軟組織支架，并對支架的各種性能進行測試，以達到足功能的生物學要求。同時進行細胞與支架的體外復合培養(yǎng)和支架植入動物體內(nèi)，探索支架對細胞、

8、組織體外及體內(nèi)的誘導機制，為組織工程化足底皮膚缺損修復提供實驗依據(jù)。本項目對重塑足功能的研究具有重要的科學和實踐意義。
　　 課題具體的研究內(nèi)容包括以下幾個方面:
　　 1.足底的顯微結構及支架構建
　　 目的:了解足底軟組織結構以及纖維、脂肪細胞在不同層次的配布、纖維的走形方向和纖維的組成情況;對足底厚度和生物力學指標進行測定，分析足底軟組織的形貌特征，為構建足底軟組織支架提供基礎的生物學數(shù)據(jù)。方法:利用手術顯

9、微鏡進行顯微解剖;HE染色和VG染色、切片、光學顯微鏡觀察;生物力學測定儀測量和電鏡掃描等方法。結果:顯微解剖觀察可見足底皮下組織纖維隔分為淺、深兩層，淺層的纖維隔小而密，深層的纖維隔大而疏。這些纖維隔分別與皮膚和足跟的筋膜緊密相連，其中有大量的纖維貫穿于纖維隔直接連接到皮膚和跟骨筋膜。HE染色顯示，足底軟組織由淺入深分為表皮、真皮、基膜和結締組織四層，其中結締組織層內(nèi)有大量的纖維，呈縱行、橫行和斜行排列編織呈立體網(wǎng)狀結構，大量的脂肪細

10、胞位于其中;VG染色證實這些纖維大部分是膠原纖維。電鏡掃描發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過脫脂處理后足底內(nèi)部可見縱橫交錯的纖維和脫落了脂肪細胞的蜂窩狀小房。這些小房有規(guī)律的排列成管道狀結構，內(nèi)部有互相連通的孔隙，與HE染色相一致。對6只尸體足底軟組織厚度進行了測量，平均厚度為18.6±1.7mm。利用生物力學測定儀對6只足底5個不同厚度的部位分別進行壓力測試，利用二次方程進行曲線擬合，R2分別為0.982、0.977、0.993、0.992和0.989，說明

11、擬合效果較好。B、D、F為不同厚度的足底皮膚結締組織樣本，其中B、D擬合曲線特征基本相同，表明足底軟組織越厚，吸收外力的能力越強。反之如H、J分別來自于足底的真皮層和表皮層，在受到外力的作用下，壓力-位移擬合曲線較平緩，說明厚度越薄，吸收外力的能力越差。結論:足底軟組織由淺、深兩層纖維隔構成的，淺層致密，纖維緊張度高，深層疏松，纖維緊張度隨外力增大逐漸增強，構成纖維隔的纖維主要是膠原纖維，其中部分膠原纖維直接連與皮膚和跟骨筋膜，限制足底

12、皮膚的過度移動，保持了足弓的穩(wěn)定性，維持了人體的平衡。同時，根據(jù)足底軟組織的結構特點，研制設計了組織工程支架模型，利用高分子蛋白質(zhì)制備了可降解的生物支架，該支架可誘導足底內(nèi)部各種細胞的生長，尤其是成纖維細胞分泌的膠原纖維可按著支架內(nèi)部的微米級(100～150μm)通道定向生長;通道內(nèi)表面粗糙，互相之間有微米級的小孔(20～40μm)連通，可促進細胞的粘附和信息的傳遞。
　　 2.支架的構建及細胞誘導功能的體外培育
　　

13、目的:模擬足底軟組織淺、深兩層的結構特點，通過電紡絲法和自制模具制備接枝絲素蛋白的聚乳酸三維多孔支架和明膠-絲素蛋白聚合支架。分別測定支架的親/疏水性、力學性能、降解性、表觀形貌和細胞相容性等性能。構建符合足底生物力學要求，組織、細胞相容性良好的可降解高分子支架，了解細胞在支架內(nèi)部的增殖、生長情況，為足底軟組織創(chuàng)傷的修復提供體外培養(yǎng)數(shù)據(jù)。方法:首先利用自行研制的電紡系統(tǒng)和自制的多通道（直徑100μm）模具制備戊二醛接枝的聚乳酸-絲素蛋白

14、(PLA-SP)納米級電紡絲支架和戊二醛交聯(lián)的多通道明膠-絲素蛋白(Gel-SP)聚合物支架。通過干燥法和質(zhì)量損失法測定支架吸水率和降解率;生物力學測定儀測定電紡支架的拉伸力和聚合支架的壓力;掃描電鏡分析支架的形貌特征;細胞與支架的共培養(yǎng)對細胞粘附率、增殖率進行測定，通過MTT活性、免疫熒光等方法，評價細胞與支架的相容性。結果:運用電紡系統(tǒng)分別對0.11g/mlPLA/DMF+CH2Cl2和0.13g/mlPLA+SP（固體比1/2）/

15、TFA在20kV電壓下進行靜電紡絲，得到直徑分別為410±193.1nm和250.7±101.5nm分布均勻、無珠狀物的纖維。力學性能測試，利用二次方程進行曲線擬合，R2分別為0.991和0.972，說明擬合效果較好，分析結果顯示，PLA-SP與PLA兩組之間差異均有統(tǒng)計學意義(F=181353.1,P＜0.001)。說明PLA-SP電紡支架具有較好的抗拉性能和伸縮性能。降解性能測試，兩組樣本降解速度差異有統(tǒng)計學意義（F=20.506，

16、P=0.011），PLA-SP組顯著高于PLA組。由降解曲線可以看出，0.11g/mlPLA/DMF+CH2Cl2多孔纖維支架隨時間延長質(zhì)量損失加大，在30天到60天內(nèi)降解速率趨于平緩。而對于以0.13g/ml(PLA-SP)(1:2)/TFA制備的多孔纖維支架在7天內(nèi)與PLA質(zhì)量損失相當，在隨后的時間里質(zhì)量損失大于PLA纖維支架，說明經(jīng)過接枝改性的PLA纖維支架的親水能力增強。不同固含量比的明膠-絲素蛋白聚合支架吸水率測定，三組支架的

17、吸水率差異有統(tǒng)計學意義（F=2447.191，P＜0.001），多重比較結果為，B、C兩組吸水率差異無統(tǒng)計學意義(p＞0.05)，A與B、C之間差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)，表明接枝改性后5:1支架的吸水率相對于10:1和1:0有明顯提高，達到3.65g/cm2。壓力測試，利用二次方程進行曲線擬合，R2分別為0.956、0.978和0.993，說明擬合效果較好。分析結果顯示:三組支架力學性能差異有統(tǒng)計學意義（F=8972.991，P

18、＜0.001），多重比較結果為，A、B、C三組之間任意兩組差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。說明不同固含量比的支架內(nèi)部的孔隙率也不相同，5:1孔隙率最大，吸收外力的能力也最強，抗壓能力最好。10:1次之，1:0最差。降解性能測試，三組樣本降解速度差異有統(tǒng)計學意義（F=63.746，P＜0.001），多重比較結果為，A、B、C三組任意兩組之間差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。1:0降解的速度最快，10:1次之，5:1較慢。說明對于

19、易溶于水的明膠和絲素蛋白，經(jīng)過接枝改性后制備的支架，其表面親水性能降低，降解速度就會變慢。細胞與支架的共培養(yǎng)，五組24h粘附率差異有統(tǒng)計學意義（F=108.651，P＜0.001），多重比較結果顯示，任意兩組間差異都有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）;五組96h增殖率差異有統(tǒng)計學意義（F=40.076，P＜0.001）。對Gel、Gel-SP和PLA、PLA-SP分別進行兩組間的方差分析，時間因素、處理因素差異均有統(tǒng)計學意義（p＜0.05）。

20、說明種植24h成纖維細胞在Gel-SP支架上的粘附率高于Gel支架，培養(yǎng)96h后Gel-SP支架上的成纖維細胞的增殖速度明顯比Gel支架快;上皮細胞在PLA-SP支架上的粘附率和增殖率均高于PLA支架。以上數(shù)據(jù)證明經(jīng)過接枝改性的支架，細胞相容性有明顯的提高。在PLA、PLA-SP中的MTT活性測定，三組支架MTT活性差異有統(tǒng)計學意義（F=2791.419，P＜0.001），多重比較結果顯示，任意兩組間MTT活性差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.

21、05），說明經(jīng)絲素蛋白改性后的聚乳酸支架與上皮細胞的相容性明顯好于單純聚乳酸支架。上皮細胞在PLA和PLA-SP電紡支架上生長的電鏡掃描圖像顯示，上皮細胞都沿著纖維方向進行生長，細胞在PLA-SP支架上的增殖速度比PLA快。共聚焦顯微鏡觀察顯示，細胞在未改性的PLA多孔支架中不易鋪展，星球狀，并發(fā)生了聚集而分布不均勻，而在表面接枝絲素蛋白的多孔支架內(nèi)部上皮細胞的鋪展性有所提高，在支架中的分布也較均勻，細胞鋪展良好。統(tǒng)計分析軟件為spss

22、13.0，支架吸水率、生物力學性能、降解性能、MTT活性的組間比較采用重復測量方差分析(RepeatedMeasures);24h粘附率、96h增值率的組間比較采用單向方差分析(0ne-WayANOVA);若總體差異有統(tǒng)計學意義，則進行多重比較(LSD);以α=0.05為檢驗水準;檢驗均為雙側(cè)。結論:固含量比5:1的Gel-SP支架和PLA-SP電紡支架具有較好的生物力學特性和細胞相容性，可作為足底皮下軟組織構建的支架材料。
　　

23、 3.改性支架對細胞、組織誘導功能的體內(nèi)培育
　　 目的:通過將不同固含量比的Gel-SP支架植入SD大鼠皮下組織內(nèi)，觀察支架在體實驗中的細胞相容性及誘導細胞、組織的生長情況。方法:選取6只體重為200～250gSD大鼠，將消毒過的支架(Gel-SP固含量比為1:0，5:1，10:1)植入同一只大鼠的皮下組織內(nèi)，在不同時間處死大鼠取材，通過HE染色和電鏡掃描進行觀察，了解不同時間細胞在支架內(nèi)部遷入情況和支架在動物體內(nèi)的降解情況

24、。結果:在植入支架7天后，沒有引起大鼠出現(xiàn)明顯的炎癥反應，僅有少量的成纖維細胞浸入支架分泌細胞外基質(zhì)，植入的支架沒有明顯的變化;17天后，大量炎癥細胞（單核細胞、巨噬細胞等）遷入支架，并有部分新生血管生成;在21天后支架內(nèi)部有大量的成纖維細胞團遷入，支架也逐步開始降解，炎癥細胞開始減少;29天5:1比10:1支架降解速度快，并有脂肪細胞的遷入;在33天后，支架內(nèi)部開始血管化，5:1支架比較明顯;41天后，支架降解明顯，血管大量長入支架，