易于血管化生物支架的構(gòu)建及其修復(fù)骨與軟組織缺損的性能評(píng)估.pdf

1、糖尿病會(huì)對(duì)人體骨代謝產(chǎn)生影響，導(dǎo)致I型糖尿病患者骨質(zhì)疏松，并增加I/II糖尿病患者骨折機(jī)率，造成骨折后延遲愈合、不愈合及假關(guān)節(jié)的出現(xiàn)。同時(shí)，糖尿病患者開放性骨折后經(jīng)常面臨皮膚創(chuàng)面，尤其是足部創(chuàng)面難以愈合并最終形成糖尿病潰瘍的風(fēng)險(xiǎn)，這是最常見也是最嚴(yán)重的糖尿病并發(fā)癥之一。隨著中國每年糖尿病患者數(shù)量的快速增加，皮膚軟組織及骨組織缺損的病例亦是逐年遞增，而如何讓創(chuàng)面及骨組織能夠快速愈合并恢復(fù)正常成為臨床上的棘手問題。因此，急需一種安全、有效、

2、易于推廣的方法來促進(jìn)愈合并阻止晚期嚴(yán)重并發(fā)癥的發(fā)生。目前，主流觀點(diǎn)認(rèn)為缺損區(qū)域周邊的血管病變及新生血管減少是導(dǎo)致缺損難愈合的最重要的局部原因之一。隨著對(duì)于糖尿病患者血管病變機(jī)理研究的深入，目前認(rèn)為低氧誘導(dǎo)因子信號(hào)通路（hypoxia inducible factor-1α/HIF-1α）的失調(diào)在該病理進(jìn)程中起著至關(guān)重要的作用。去鐵胺(desferrioxamine/DFO)是一種能夠在常氧條件下激活 HIF-1α信號(hào)通路的化合物，稱為“

3、低氧模擬化合物”。因此低氧模擬化合物可能對(duì)糖尿病患者骨與軟組織缺損修復(fù)具有潛在作用。目前，靜電紡絲及水凝膠等新型材料技術(shù)制備的支架是藥物的優(yōu)良載體，能夠?qū)崿F(xiàn)藥物定點(diǎn)、定量及可控緩釋。如何將低氧模擬化合物與生物材料有機(jī)結(jié)合并應(yīng)用于骨與軟組織修復(fù)，值得我們進(jìn)行深入有益的探索。
　　目的：
　　構(gòu)建負(fù)載低氧模擬化合物的新型支架材料，通過體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其易于血管化的作用并闡述其分子機(jī)制及細(xì)胞信號(hào)通路。
　　方法：
　

4、　1.腹腔注射鏈脲霉素（streptozotocin/STZ）誘導(dǎo)I型糖尿病SD大鼠（type1 diabetes mellitus sprague dawley rat/T1DM SD rat），與同周齡正常大鼠進(jìn)行對(duì)比，通過Micro-CT、三點(diǎn)彎曲力學(xué)試驗(yàn)驗(yàn)證其骨質(zhì)疏松存在，并通過Western blot證實(shí)高血糖環(huán)境中HIF-1α通路受損。利用靜電紡絲技術(shù)構(gòu)建負(fù)載DFO的PCL（polycaprolactone）管狀纖維支架，通

5、過掃描電鏡觀察支架材料微觀結(jié)構(gòu)。體外選用小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（murine bone marrow stem cells/mBMSCs）驗(yàn)證載藥材料的生物相容性，并利用Realtime-PCR技術(shù)檢測(cè)該細(xì)胞在支架釋放藥物干預(yù)下相關(guān)成血管及成骨mRNA表達(dá)情況；選用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cell/HUVEC）檢驗(yàn)材料成管特性。體內(nèi)試驗(yàn)中，構(gòu)建T1DM大鼠股骨遠(yuǎn)端骨缺損模型，通過

6、Micro-CT、X-ray、組織形態(tài)學(xué)等方法評(píng)價(jià)DFO對(duì)糖尿病骨質(zhì)疏松性骨缺損修復(fù)的作用。
　　2.構(gòu)建攜載DFO的親水性PVA（polyvinyl alcohol）- CS（chitosan）復(fù)合靜電紡絲纖維膜，通過掃描電鏡、FTIR（fourier transform infrared spectroscopy）光譜儀等方法檢測(cè)材料表征及藥物緩釋效果，隨后驗(yàn)證其生物特性。體外選用人皮膚原代成纖維細(xì)胞（human dermal

7、 fibroblast/HFB）驗(yàn)證載藥材料的生物相容性并檢測(cè)HIF-1α等相關(guān)成血管蛋白表達(dá)情況；選用HUVEC檢驗(yàn)材料成管特性。體內(nèi)試驗(yàn)中，在T1DM大鼠背部構(gòu)建全層皮膚缺損；利用組織形態(tài)學(xué)、Realtime-PCR、Western blot等方法評(píng)價(jià)創(chuàng)面愈合速度及質(zhì)量，同時(shí)闡明HIF-1α信號(hào)通路變化。
　　3.通過物理共混方法將DFO與可注射光交聯(lián)Gelma（gelatin methacrylamide）水凝膠相結(jié)合，構(gòu)建

8、復(fù)合載藥支架材料。通過掃描電鏡觀察支架微觀表征及藥物分布情況。利用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)藥物緩釋效果。體外選用HFB及HUVEC檢驗(yàn)支架生物相容性及相關(guān)蛋白表達(dá)情況。體內(nèi)通過構(gòu)建T1DM大鼠背部全層皮損模型，利用組織形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證水凝膠支架材料修復(fù)效果。
　　結(jié)果：
　　1. T1DM大鼠存在明顯的骨質(zhì)疏松，HIF-1α信號(hào)通路受損。負(fù)載DFO的PCL管狀纖維支架具有良好的生物相容性并能夠上調(diào) mBMSCs內(nèi)成血管相關(guān)的vegf

9、以及成骨相關(guān)的runx-2、osteocalcin的mRNA的高表達(dá)，并能有效誘導(dǎo)HUVEC成管；DFO干預(yù)組大鼠股骨遠(yuǎn)端骨缺損處的骨密度、骨量、血管含量較對(duì)照組明顯升高；骨骼中HIF-1α、RUNX-2蛋白表達(dá)要高于對(duì)照組，成骨活躍，愈合速度加快。
　　2.攜載DFO的親水性PVA- CS復(fù)合靜電紡絲纖維支架擁有優(yōu)秀的吸水和機(jī)械性能，微觀纖維結(jié)構(gòu)能夠有效促進(jìn)HFB粘附、增殖，細(xì)胞內(nèi)HIF-1α、VEGF等成血管相關(guān)蛋白表達(dá)量均高

10、于對(duì)照組。同時(shí)可以促進(jìn) HUVEC有效成管；在體內(nèi)，纖維支架材料具有與創(chuàng)面愈合進(jìn)程相匹配的降解速度及藥物釋放速度，可以快速募集成血管相關(guān)細(xì)胞及因子進(jìn)入損傷區(qū)域，并能夠加強(qiáng)HFB及HUVEC兩種細(xì)胞的協(xié)同作用，生成血管、促進(jìn)表皮再生、加速I/III型膠原轉(zhuǎn)化，最終修復(fù)創(chuàng)面。
　　3.負(fù)載DFO的光交聯(lián)Gelma水凝膠支架材料具有良好的生物相容性，形態(tài)可塑且不受創(chuàng)面大小、深淺限制，能夠?yàn)榧?xì)胞長入、增殖、分化提供相對(duì)封閉穩(wěn)定的3D微環(huán)境