LPS腹腔注射誘發(fā)大鼠腦內炎癥致皮層與海馬病理改變及相關機制研究.pdf

1、包括神經退行性病變在內的多數(shù)中樞神經系統(tǒng)疾病均可能與外周炎癥過程相關。炎癥雖可作為機體抵抗外來刺激的防御性反應，但過度的炎癥反應也可造成組織損傷，推動疾病發(fā)展。外周炎癥過程可導致如發(fā)熱、厭食等病理反應，提示特定炎癥物質可將外周炎癥信號傳遞至中樞神經系統(tǒng)。但這種炎癥信號對腦內特定部位，如與認知、學習記憶相關的大腦皮層和海馬等區(qū)域，是否也有影響，并導致相關的病理改變，其機制如何，至今未見系統(tǒng)報道。
　　 腹腔注射脂多糖（lipopo

2、lysaccharide，LPS）炎癥模型中，花生四烯酸代謝產生的炎癥物質前列腺素E2（prostaglandinE2，PGE2）和白三烯C4（leukotrieneC4，LTC4）作用于下丘腦相關腦區(qū)，誘導發(fā)熱、厭食等癥狀。由于該類炎癥物質可在腦內廣泛產生并易于擴散，因而推測，它們也可作用于大腦皮層及海馬等與認知、記憶功能密切相關的腦區(qū)，并可能作為始動因素誘發(fā)下游病理改變。
　　 然而，在整體炎癥模型中，大腦皮層及海馬腦區(qū)內P

3、GE2和LTC4的生成及其合成酶系表達情況至今未見系統(tǒng)報道，亟需展開相關研究。本研究第一部分采用LPS腹腔注射致腦炎模型，探索致炎后大鼠大腦皮層及海馬內該兩炎癥物質的生成情況，并以環(huán)氧合酶抑制劑吲哚美辛（indomethacin，INDO）作為工具藥，研究PGE2調控大腦皮層及海馬中3-硝基化酪氨酸（3-nitrotyrosine，3-NT）形成，從而論證PGE2作為始動因素推動腦內相關病理改變的作用。
　　 另一方面，炎癥過程

4、誘導生成腫瘤壞死因子α（tumornecrosisfactorα，TNF-α），TNF-α參與各種急、慢性中樞神經系統(tǒng)炎癥反應。相關研究表明，TNF-α信號通路可上調BACE1表達造成海馬腦區(qū)內淀粉樣蛋白生成增加，進而推動阿爾茨海默?。ˋlzheimer'sdisease，AD）的發(fā)展。BACE1直接參與淀粉樣肽（amyloidb，Aβ）形成，因而是一種具有重要病理意義的標志性蛋白。本研究第二部分采用LPS腹腔注射致腦炎模型及體外培養(yǎng)神

5、經元、星型膠質細胞體系，以TNF-α抑制劑依那西普（etanercept，ETC）為工具藥，論證TNF-α信號通路干預BACE1表達的作用及其機制。
　　 本研究利用體內、外多種炎癥生物學體系，系統(tǒng)研究以PGE2、TNF-α為主的炎癥物質對大腦內調控情況，既關注以大腦皮層，海馬等病理學改變?yōu)樘卣鞯脑缙诓±韺W靶點，又關注論證“PGE2-ONOO-3-NT/BACE1”炎癥事件，以期揭示炎癥過程推動腦內病理改變的生物學本質，為尋找神

6、經退行性改變相關的藥物作用新靶點提供思路。
　　 1.LPS致大鼠大腦皮質海馬PGE2、LTC4合成酶系表達變化及3-硝基酪氨酸形成
　　 探索LPS致大鼠腦部炎癥模型中，大腦皮層及海馬區(qū)域PGE2和LTC4合成酶系表達及產物生成情況，并論證其對腦內病理改變的影響。
　　 LPS（2mg/kg，i.p.）可致雄性成年SD大鼠體溫升高，幅度、時相均與文獻報道相符，提示腦部炎癥造模成功。大腦皮層、海馬組織mPGES-

7、1于24h內呈時間依賴性表達上調，腦微血管內皮細胞及錐體神經元均可見其表達，PGE2水平同步增高；另一方面，LPS作用1h后，在基因、蛋白水平，均可見大腦皮層及海馬內LTC4S均呈現(xiàn)一過性上調，并伴隨LTC4合成能力增強。mGST3表達未受LPS作用影響，未檢測出上述腦區(qū)內mGST2的表達。
　　 一氧化氮合酶（nitricoxidesynthases，NOSs）及NADPH氧化酶（NADPHoxidases，NOXs）是體內催

8、化NO及ROS的主要酶系。研究發(fā)現(xiàn)，LPS致炎1d可導致海馬組織內皮型及誘生型NOS（eNOS，iNOS）及神經元特異性NOX4蛋白表達上調，提示海馬組織生成NO及ROS。兩者反應生成亞硝基陰離子（peroxynitrite，ONOO），并導致3-NT形成，該過程與AD發(fā)病密切相關。免疫組化結果表明，LPS致炎7d可致大鼠海馬組織3-NT水平顯著上調，提示上述炎癥過程可在早期啟動或促進AD病程。誘導細胞凋亡是3-NT重要下游毒性機制之一

9、，westernblot結果顯示，LPS致炎7d伴隨海馬組織凋亡相關蛋白caspase-8及Bax表達上調。提示3-NT形成可能通過多種途徑參與啟動細胞凋亡過程。INDO預給藥，可抑制LPS引起的動物發(fā)熱，并部分抑制LPS所致海馬組織eNOS、iNOS及NOX4上調，進而緩解海馬部位3-NT形成，及caspase-8及Bax上調，提示炎癥物質PGE2參與調控NO及ROS生物合成，并經由3-NT誘導的細胞凋亡影響細胞存活。
　　

10、細胞絲裂素活化蛋白激酶（mitogen-activatedproteinkinases，MAPKs）信號通路可在早期參與AD相關的多種分子生物學事件調控。研究發(fā)現(xiàn)INDO可在極早期顯著抑制LPS誘導的ERK1/2磷酸化激活，但未見其對p38磷酸化水平調控，提示PGE2可能經由激活ERK1/2信號通路參與對iNOS表達調控，而p38信號通路未體現(xiàn)介導PGE2相關的下游分子事件。
　　 本研究結果表明，外周注射LPS致大鼠腦部炎癥模

11、型中，大腦皮層及海馬腦區(qū)內PGE2及LTC4合成酶系表達發(fā)生變化，提示該兩炎癥物質存在于上述腦區(qū)。外周LPS炎癥刺激通過誘導PGE2生成，上調海馬腦區(qū)內NOSs及NOX4表達變化，進而促進3-NT形成，并誘導細胞凋亡傾向增加，提示PGE2作為重要早期因素參與3-NT形成。MAPKs信號通路與上述調控過程有關。
　　 2.LPS致大鼠炎癥經由TNF-α調控星型膠質細胞淀粉樣前體蛋白β位剪切酶表達及機制研究
　　 本研究探索

12、炎癥介質TNF-α、PGE2對BACE1表達的調控作用。
　　 LPS（2mg/kg,i.p.）可導致大鼠海馬組織內BACElmRNA、蛋白表達、活性及其酶切產物分泌型淀粉樣蛋白β（secretedAPPβ，sAPPβ）呈時間依賴性上調。免疫熒光化學復染結果顯示，上調BACE1與星型膠質細胞標志蛋白纖維酸性蛋白（glialfibrillaryacidicprotein，GFAP）高度重合。該結果表明，LPS致大鼠腦部炎癥過程中，

13、海馬部位星型膠質細胞與上調BACE1密切相關，提示該炎癥過程可能經由上調BACE1這一AD病程中的早期關鍵蛋白推動病程發(fā)展，其中星型膠質細胞是介導該作用的主要細胞類型。進一步論研究顯示，預給予ETC（5mg/kg,sue.）可顯著降低LPS所致大鼠海馬組織BACE1蛋白及sAPPβ表達上調；蛋白定位結果顯示，上調的BACE1集中表達在星型膠質細胞中，而不與神經絲表達陽性的神經元共表達。以上結果提示了TNF-α信號通路及星型膠質細胞在LP

14、S所致BACE1上調過程中的重要作用。
　　 為進一步驗證上述結果，將體外培養(yǎng)原代大鼠大腦皮層星型膠質細胞及神經元與TNF-α共孵育。結果表明，TNF-α在10-150ng/ml范圍內，可濃度依賴地上調星型膠質細胞中BACE1蛋白表達，而同濃度TNF-α不影響神經元中BACE1蛋白表達。體內、外實驗均提示，TNF-α可通過調控星型膠質細胞中BACE1表達，影響AD病理過程。由于INDO（2mg/kg,i.p.）未能影響LPS所致

15、大鼠海馬BACE1表達上調，提示PGE2并未參與炎癥刺激下BACE1表達調控，間接映證了TNF-α對BACE1表達的重要調控作用。
　　 TNF-α可誘導腦內星型膠質細胞激活、增殖，提示星型膠質細胞中TNF-α信號通路與AD發(fā)病密切相關。本研究發(fā)現(xiàn)，LPS誘導外周炎癥過程中產生的炎癥因子TNF-α參與上調星型膠質細胞中BACE1蛋白表達。體外實驗結果支持TNF-α信號通路及星型膠質細胞在AD發(fā)病過程中的重要作用。
　　

16、以上實驗表明：
　　 1.外周注射LPS致大鼠體溫升高急性時相內，大腦皮層及海馬組織及微血管內皮細胞內mPGES-1表達上調，PGE2水平增加；LTC4S呈現(xiàn)一過性表達升高，未見其同工酶mGST2表達，mGST3表達未受LPS影響。提示腹腔注射LPS可誘導大腦皮層及海馬腦區(qū)mPGES-1和LTC4S活性增加，產生炎癥因子PGE2及LTC4。
　　 2.外周注射LPS可導致海馬組織NOSs、NOX4表達依次上調，NO、RO