利用轉(zhuǎn)基因小鼠模型研究FHL3基因?qū)Σ煌±w維類型形成的影響.pdf

1、肌肉是由不同類型的肌纖維構(gòu)成，根據(jù)肌球蛋白重鏈的不同可將肌纖維類型分為Ⅰ型、Ⅱa型、Ⅱb型和Ⅱx型等四種。四種不同肌纖維在肌肉中所占比例的變化影響著肌肉的品質(zhì)，因此研究不同肌纖維類型之間的轉(zhuǎn)化對(duì)改良肌肉的品質(zhì)具有重要意義。FHL3蛋白是LIM蛋白家族一員，本課題組前期研究表明在C2C12成肌細(xì)胞中超表達(dá)FHL3基因可抑制MyHCⅠ基因的表達(dá)，促進(jìn)MyHCⅡa和MyHCⅡb基因的表達(dá)，但在活體水平FHL3基因?qū)Σ煌±w維類型的影響仍不清楚

2、。本研究以肌肉超表達(dá)FHL3轉(zhuǎn)基因小鼠為模型，在活體水平上驗(yàn)證了該基因?qū)Σ煌±w維類型形成的影響。具體研究結(jié)果如下:
　　1.構(gòu)建了pEGFP-N1L-MCK-FHL3肌肉特異表達(dá)的轉(zhuǎn)基因載體，利用PCR技術(shù)成功篩選獲得FHL3陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因小鼠，采用Q-PCR法和熱不對(duì)稱交錯(cuò)式PCR法檢測(cè)了F0、F1代陽(yáng)性小鼠外源FHL3基因拷貝數(shù)及F0代51號(hào)小鼠FHL3基因的插入位點(diǎn)，結(jié)果表明外源基因FHL3是以連續(xù)多個(gè)拷貝的方式插入小鼠基因組

3、內(nèi)，且51號(hào)個(gè)體FHL3基因插入在小鼠4號(hào)染色體內(nèi)。
　　2.統(tǒng)計(jì)了F0代小鼠窩產(chǎn)仔數(shù)、F1代小鼠陽(yáng)性率以及生長(zhǎng)曲線，結(jié)果表明F0代轉(zhuǎn)基因母鼠的窩產(chǎn)仔數(shù)顯著高于野生母鼠，F(xiàn)0代轉(zhuǎn)基因公鼠所產(chǎn)后代陽(yáng)性率顯著低于F0代轉(zhuǎn)基因母鼠所產(chǎn)后代的陽(yáng)性率，2-8周齡轉(zhuǎn)FHL3基因公鼠和母鼠的體重與野生公鼠和母鼠的體重?zé)o顯著差異。
　　3.利用Q-PCR方法檢測(cè)了FHL3基因在2月齡轉(zhuǎn)基因小鼠和野生小鼠的心、肝、脾、肺、腎、腦、小腸、胃、脂

4、肪、肌肉、睪丸等組織中的表達(dá)量，結(jié)果表明轉(zhuǎn)FHL3基因小鼠的心肌、骨骼肌、睪丸中，F(xiàn)HL3基因的mRNA表達(dá)量顯著高于野生鼠。
　　4.對(duì)2月齡小鼠股四頭肌進(jìn)行石蠟包埋、切片、HE染色，利用Image J軟件對(duì)股四頭肌肌纖維數(shù)目和橫截面積分別進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)FHL3基因小鼠的肌纖維數(shù)目和橫截面積與野生鼠相比均無(wú)顯著差異。
　　5.提取2月齡轉(zhuǎn)FHL3基因小鼠和野生小鼠腓腸肌組織的RNA和蛋白，利用Q-PCR和West

5、ern blotting技術(shù)分別檢測(cè)了FHL3、MyHCⅠ、MyHCⅡa、MyHCⅡb等基因的mRNA和蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因小鼠中FHL3、MyHCⅡa、MyHCⅡb基因的mRNA和蛋白表達(dá)量顯著高于野生鼠，MyHCⅠ基因的mRNA和蛋白表達(dá)量顯著低于野生鼠。
　　6.利用ATP酶染色和SDH染色區(qū)分2月齡小鼠比目魚肌和股四頭肌中的不同肌纖維類型，與非轉(zhuǎn)基因小鼠相比，轉(zhuǎn)基因小鼠Ⅰ型纖維顯著降低，Ⅱ型纖維顯著上升。