人蛋白C的研制及其相關研究.pdf

1、該研究包括:1物理化學方法純化人血漿蛋白C:將3000ml新鮮冷凍血漿為起始材料,以DEAE-Sephadex A 50為吸附介質(zhì),收集洗脫產(chǎn)物,再經(jīng)DEAE-Sepharose FF及肝素-Sepharose CL 6B層析,對收集產(chǎn)物進行APTT、SDS-PAGE及Western blotting檢測,獲得純度大于95﹪的人血漿蛋白C.2人蛋白C cDNA在CHO-dhfr-細胞中的表達:利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術將含有人蛋白C cDNA基

2、因和二氫葉酸還原酶基因的載體轉(zhuǎn)入CHO細胞中,經(jīng)過MTX(6.4umol/L)抗性篩選,APTT、SDS-PAGE及Westem blotting檢測獲得了6株高表達的細胞株.3人蛋白C單克隆抗體的制備與鑒定:利用人血漿蛋白C純化產(chǎn)物免疫BALB/C小鼠制備了5株人蛋白C單克隆抗體細胞株,分別進行了效價、亞類、特異性及親和力等鑒定.4人蛋白C單克隆抗體的初步應用1)酶聯(lián)免疫分析法檢測人血漿蛋白C:利用兩株識別不同人蛋白C位點的單克隆抗體

3、細胞株建立了夾心ELISA檢測人血漿蛋白C.此方法可用于檢測血漿中3.12~200ng/mL范圍內(nèi)蛋白C,實驗可在4小時內(nèi)完成,實驗的批內(nèi)和批間變異不超過7﹪,測得102份正常血漿樣品的參考范圍是4.02±0.295μg/mL 2)親合層析法純化人血漿蛋白C:先用DEAE-Sephadex A-50吸附人血漿,然后將吸附產(chǎn)物過人蛋白C單克隆抗體與溴化氫活化的Sepharose 4B偶聯(lián)制備親和層析柱,獲得人蛋白C的純化產(chǎn)物.此方法可使純