鈉離子依賴的中性氨基酸轉運蛋白2(SNAT2)多克隆抗體的制備、純化及檢測.pdf

1、目的:鈉離子依賴的中性氨基酸轉運蛋白2(Sodium-dependentneutralaminoacidtransporter2，SNAT2)是SLC38蛋白家族中的一員，跨膜轉運小的中性氨基酸，廣泛表達于哺乳動物組織中。SNAT2的功能紊亂可以導致許多神經(jīng)性疾病，如阿爾茨海默癥、帕金森癥等。在大腦中，SNAT2主要轉運谷氨酰胺進入細胞，參與谷氨酸-谷氨酰胺的循環(huán)，因此具有重要的生理功能。本研究通過克隆編碼SNAT2蛋白氨基端75個氨基

2、酸基因，構建pET28-SNAT2-75aa原核表達載體，誘導融合蛋白表達，并用純化的目的蛋白免疫大白兔獲得SNAT2多克隆抗體?？贵w經(jīng)親和純化，得到特異性強、檢測效率高的SNAT2多抗，為SNAT2蛋白功能及其結構的深入研究奠定了生化基礎。
　　方法:本研究采用PCR方法擴增得到SNAT2氨基端75個氨基酸的編碼序列，構建重組質粒pET28a-SNAT2-75aa，并將其轉入大腸桿菌BL21(DE3)中，通過IPTG誘導表達重組

3、蛋白。利用組氨酸標簽蛋白經(jīng)鎳柱親和純化后得到了純度在95％以上的SNAT2氨基端蛋白SNAT2-75aa，將其作為免疫原免疫新西蘭大白兔，從而獲得SNAT2多克隆抗體。采用巰丙基瓊脂糖凝膠6B(Thiopropylsepharose)固定抗原親和純化法進一步對該抗體進行純化，蛋白免疫印跡確定該抗體對SNAT2具有高度的特異性。
　　結果:純化前的SNAT2抗體，經(jīng)間接ELISA檢測其效價為1∶512000，但Westernblot

4、檢測結果并不理想。采用巰丙基瓊脂糖凝膠6B(Thiopropylsepharose)固定抗原親和純化法進一步對該抗體進行純化，用Westernblot的方法檢測親和純化后的SNAT2多克隆抗體，對融合蛋白SANT2-75aa和哺乳動物細胞中表達的全長SNAT2蛋白的特異性，結果顯示純化后的SNAT2抗體對SNAT2蛋白氨基端75個氨基酸及SNAT2蛋白均具有高度特異性，且檢測效價至少提高了十倍。
　　結論:在原核表達系統(tǒng)中成功表達