VDAC2融合蛋白理化性質(zhì)的研究及多克隆抗體的制備.pdf

1、VDAC(電壓依賴性陰離子通道蛋白)是廣泛分布于所有真核生物線粒體外膜的一種豐富蛋白。近年來，在不同的物種發(fā)現(xiàn)了幾種VDAC孔道亞型，它由不同的基因編碼，哺乳類動物至少存在三種亞型：VDAC1、VDAC2、VDAC3。VDAC跨膜結(jié)構(gòu)包含一個α螺旋和13-16個β折疊。 VDAC被公認(rèn)的主要功能是維持線粒體外膜幾乎完全的通透性。其閉合可以導(dǎo)致線粒體膜通透性的改變，與各種代謝產(chǎn)物ATP、ADP、NADH以及陰離子、陽離子的跨膜轉(zhuǎn)運

2、有關(guān)。很多證據(jù)表明VDAC對線粒體和細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)非常重要，目前對VDAC研究的熱點是VDAC在能量代謝障礙及在細(xì)胞凋亡中的作用。對此通道蛋白功能的研究目前都是把提純的VDAC蛋白質(zhì)重組到人工的脂質(zhì)膜上來進行，因而限制了對VDAC進一步的研究。要想深入了解VDAC蛋白的功能就必須解析它的三維結(jié)構(gòu)。但是對蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的解析和功能的研究常常需要毫克數(shù)量級的高純度蛋白，而內(nèi)在膜蛋白含量很低，跨膜受體蛋白的含量一般為微克數(shù)量級，難以純化到可以

3、供培養(yǎng)三維晶體所需要的量，因而很多學(xué)者開始嘗試通過原核載體超量表達(dá)膜蛋白，但目前仍未找到一種有效的方法，本課題也是從這個角度出發(fā)，在前期成功克隆基因構(gòu)建載體的基礎(chǔ)上，嘗試建立該蛋白的體外原核表達(dá)，誘導(dǎo)其大量表達(dá)并通過分離和初步純化獲得較高純度的融合蛋白產(chǎn)物，通過蛋白酶切獲得了目的蛋白。 研究方法: 1．重組蛋白pET-CKS-VDAC2、pET-Trx-VDAC2的誘導(dǎo)表達(dá)和純化、理化性質(zhì)的研究及蛋白酶切。 1.

4、1 將重組質(zhì)粒pET-CKS-VDAC2和pET-Trx-VDAC2轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)pLyss，擴增提取質(zhì)粒，行PCR、限制性內(nèi)切酶酶切鑒定。鑒定正確無誤后開始下一步表達(dá)。 1.2 將鑒定正確的重組質(zhì)粒pET-CKS-VDAC2和pET-Trx-VDAC2轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)pLyss，按照已經(jīng)優(yōu)化好的條件誘導(dǎo)大量表達(dá)工程菌，離心收集菌液。重懸后經(jīng)超聲破碎離心分離得到BL21(DE3)pLyss原核表達(dá)

5、系統(tǒng)表達(dá)的融合蛋白包涵體。 1.3 對融合蛋白包涵體進行洗滌及變性條件的摸索。分別選用三種不同的去污劑SDS、TritonX-100、DOC和一種變性劑尿素溶解包涵體，SDS-PAGE電泳分析選出助溶劑。再通過實驗選擇比較融合蛋白在助溶劑中的穩(wěn)定性，以及在酸性堿性環(huán)境下的穩(wěn)定性。最終選擇合適的包涵體助溶劑以及穩(wěn)定的pH緩沖液。 1.4 包涵體溶解后，在AKTA快速蛋白純化液相色譜系統(tǒng)(FPLC)上運用HiTrap Q s

6、epHarose初步分離純化。經(jīng)梯度復(fù)性后的融合蛋白用P3C酶過夜酶切。 2．多克隆抗體的制備 2.1 以純化后的融合蛋白pET-CKS-VDAV2作為抗原按照常規(guī)方法免疫家兔，通過數(shù)次加強免疫收集兔血清，獲得抗pET-CKS-VDAC2多克隆抗體。 2.2 采用硫酸銨沉淀法對抗血清進行純化，用EIASA法測定多抗效價。用Western-Blot法檢測抗體特異性。 實驗結(jié)論: 1．在大腸桿菌中成功