人類白細胞抗原G在人類早期胚胎免疫耐受、生長發(fā)育和著床中作用的研究.pdf

1、研究背景:HLA-G是主要組織相容復合物(MHC)Ib分子,選擇性表達于母胎界面。研究發(fā)現(xiàn)HLA-G在人類生殖有多方面的功能。小鼠植入前胚胎發(fā)育基因(Ped)產(chǎn)物Qa-2蛋白是小鼠的MHCIb分子，研究發(fā)現(xiàn)表達Qa-2蛋白的小鼠胚胎卵裂速度明顯加快，并且更容易存活。許多IVF中心的數(shù)據(jù)表明在人類胚胎也存在小鼠的Ped現(xiàn)象因為受精時間相同的胚胎會有不同的卵裂速度和IVF結(jié)局。HLA-G被證明在人類早期胚胎有表達，并且研究發(fā)現(xiàn)人類的HLA-

2、G可能是小鼠Qa-2蛋白的功能類似物。最近大量的研究發(fā)現(xiàn)在IVF周期中分泌的可溶型HLA-G的胚胎可能會有更高的種植率、妊娠率和活產(chǎn)率。成功的妊娠只有在發(fā)育良好的早期胚胎植入子宮蛻膜并且不被母體免疫系統(tǒng)所排斥才能實現(xiàn)。種植過程的開始是由囊胚的滋養(yǎng)細胞與蛻膜表面的上皮細胞接觸并建立聯(lián)系，然后是兩者之間緊密的粘附和浸潤子宮蛻膜。有粘附能力的滋養(yǎng)細胞和接受狀態(tài)的子宮內(nèi)膜都是必需的。這一過程部分是由滋養(yǎng)細胞和母體子宮微環(huán)境控制的。dNK細胞是主

3、要的母體蛻膜免疫細胞，可用直接裂解滋養(yǎng)細胞。HLA-G被認為可以保護靶細胞（滋養(yǎng)細胞和某些腫瘤細胞）不被NK細胞裂解。許多研究表明某些由于滋養(yǎng)細胞增殖和浸潤異常有關(guān)的妊娠相關(guān)疾病與HLA-G的異常表達有關(guān)。因此，HLA-G可能具有調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細胞增殖、分化的功能，同時保護這些細胞免受母體免疫細胞的攻擊。HLA-G的研究是一個相對較新的領(lǐng)域，目前HLA-G的確切功能仍然不明確。需要大量的研究工作對其進行深入研究。闡明HLA-G的功能和作用機制

4、對我們深入了解妊娠的免疫調(diào)節(jié)狀態(tài)和妊娠相關(guān)疾病的發(fā)病機制有重要意義。同樣有助于了解移植物的免疫排斥反應(yīng)和腫瘤的浸潤機制。我們的研究對輔助助孕技術(shù)有潛在的臨床應(yīng)用價值。
　　研究目的:基于大量的研究認為HLA-G是對人類生殖過程極其重要的分子，我們假設(shè)缺乏HLA-G的滋養(yǎng)細胞更易于被母體免疫細胞攻擊，粘附和浸潤子宮蛻膜不良。這種缺陷的滋養(yǎng)細胞會導致胚胎植入失敗和與蛻膜浸潤不良胎盤淺著床有關(guān)的疾病。低表達HLA-G的滋養(yǎng)細胞和人類早期

5、胚胎可能會有增殖和卵裂障礙，導致胎盤和胚胎發(fā)育不良。本研究的目標是闡明下述幾個問題：(1)在滋養(yǎng)細胞來源的細胞系中，HLA-G表達水平的改變是否會引起NK對其細胞毒作用的變化；(2)HLA-G是否有促進人類早期胚胎和滋養(yǎng)細胞來源細胞分裂和增殖的功能；(3)HLA-G是否能調(diào)控滋養(yǎng)細胞來源細胞的粘附和浸潤過程。
　　研究方法:應(yīng)用RNAi技術(shù)，我們創(chuàng)新構(gòu)建了可以轉(zhuǎn)錄出特異干涉HLA-GmRNA的siRNA的重組腺病毒載體來下調(diào)HLA

6、-G表達水平。使用高表達HLA-G的JEG-3細胞系（來源于人絨毛膜癌細胞）進行滋養(yǎng)細胞功能研究。通過RT-PCR和Westernblot檢測重組腺病毒載體轉(zhuǎn)染后JEG-3中HLA-G表達水平，建立HLA-G低表達的滋養(yǎng)細胞模型。用這種細胞模型進行非放射法NK細胞毒實驗。用重組腺病毒載體轉(zhuǎn)染或抗HLA-G單克隆抗體封閉后的JEG-3細胞進行增殖和浸潤實驗。增殖實驗采用XTT法。浸潤實驗使用購買的invasion試劑盒。通過X-Gal染色

7、法檢測重組腺病毒載體感染小鼠胚胎的效率并確定最佳MOI值。使用腺病毒載體轉(zhuǎn)染3PN的第3天人類胚胎，觀察卵裂速度的變化。
　　結(jié)果:(1)我們構(gòu)建的重組腺病毒載體可以高效轉(zhuǎn)染JEG-3細胞，在MOI100時感染效率可達到100％，并且產(chǎn)生明顯HLA-GRNAi效果，可以降低JEG-3細胞中23.73％HLA-GmRNA和48.36％HLA-G蛋白表達水平；(2)JEG-3細胞中HLA-G表達水平的降低可以明顯增加NK92細胞對其的

8、殺傷作用；在E:T比例為10:1,5:1和2.5:1時，HLA-GsiRNA組和錯配對照組的％細胞毒分別是：58.82％比67.65％,51.47％比60.29％和39.71％比48.53％，差異有顯著性；(3)Ad可以有效轉(zhuǎn)染小鼠和人類早期胚胎；使用106pfu/ml誘導HLA-GRNAi的腺病毒載體感染的3PN第3天人類胚胎，感染后的胚胎卵裂速度明顯減慢，92.31％(12of13)感染后胚胎在繼續(xù)培育的2天里停止分裂，培養(yǎng)至第5天

9、的胚胎平均卵裂球數(shù)只有17.71±6.57個。(4)用重組腺病毒載體轉(zhuǎn)染或抗HLA-G單克隆抗體封閉后的JEG-3細胞增殖速度減慢，但結(jié)果沒有統(tǒng)計學意義。下調(diào)JEG-3細胞HLA-G表達后細胞浸潤能力顯著下降：轉(zhuǎn)染錯配對照Ad組和轉(zhuǎn)染AdsiRNA組的OD592值分別為0.790±0.048和0.605±0.133，有統(tǒng)計學差別；加入AntiHLA-GMAb4H841ug/ml組與0ug/ml組OD592值分別為0.626±0.106和

10、0.923±0.025，有統(tǒng)計學差別。
　　結(jié)論:這些結(jié)果表明我們構(gòu)建的重組腺病毒載體是建立低表達HLA-G的滋養(yǎng)細胞和胚胎模型進行HLA-G功能研究的有效工具。據(jù)我們所知這是首次使用轉(zhuǎn)錄siRNA的腺病毒載體進行HLA-G在人類早期胚胎功能的研究。我們的結(jié)果直接顯示了HLA-G對JEG-3細胞具有保護其免受NK殺傷的功能。此外，HLA-G在人類生殖過程中具有非免疫學功能。我們發(fā)現(xiàn)HLA-G低表達胚胎卵裂速度顯著減慢。HLA-G表