hPPARs天然配體篩選平臺的建立及應用.pdf

1、目的：建立人過氧化物酶體增殖物活化受體(human peroxisomeprolifterator-activated receptors，hPPARs)配體的篩選平臺，并從中藥單體中篩查hPPARs的天然配體。 方法：從人肝癌組織提取總RNA，RT-PCR擴增出hPPARs配體結合區(qū)(ligand binding domain，LBD)cDNA，將其克隆入表達載體pMAL-p2x麥芽糖結合蛋白(maltose binding

2、protein，MBP)編碼基因malE序列的下游，轉化入Ecoli.TB1。含重組質粒的宿主菌經最佳優(yōu)化條件誘導后，超聲破碎取上清。產物用多糖親和樹脂進行純化，純化的MBP-hPPARsLBD用Xa因子酶切、多糖親和樹脂層析、DEAE-52陰離子交換層析純化回收。放射性標記配基結合實驗(radioligand binding assays，RBA)鑒定MBP-hPPARsLBD和hPPARsLBD的配體結合功能。高效液相色譜紫外檢測法

3、(high performance liquid chromatography and ultraviolet detection，HPLC-UV)建立hPPARsLBD配體的篩選平臺，并對待試中藥單體進行篩選，用經典的放射性標記配基競爭結合實驗(radioligand binding competition assays，RBCA)法對HPLC-UV法篩選結果進行檢驗。反式激活報告基因法測定篩出藥物的功能活性。 結果：含重組質

4、粒的宿主菌經最佳優(yōu)化條件(0.4mmol/L，30℃振蕩培養(yǎng)6h)誘導，從1L培養(yǎng)物中可獲得約20mg MBP-hPPARsLBD，約占胞質總蛋白的31％。經純化以及酶切回收，獲得了電泳純的MBP-hPPARsLBD和hPPARsLBD，其產量分別為14mg/L和5mg/L，得率分別為70％和 45％。RBA顯示MBP-hPPARsLBD和hPPARsLBD的結合配體功能是等效的。根據(jù)分子排阻色譜分離(Molecular Exclusi

5、on Chromatography，MEC)理論建立了HPLC-UV法hPPARs配體篩選平臺。用該平臺對待試藥進行了篩選，結果顯示小檗堿(berberine，Ber)和柚皮素(naringenin，Nar)能特異性結合hPPAR α，大豆苷元(daidzein，Dai)能特異性結合hPPAR α和hPPAR γ1。RCBA法結果與HPLC-UV法相同。用反式激活報告基因法測試待試中藥單體的功能活性，結果顯示，Dai、Ber和Nar能激

6、活hPPARα，Dai、Nar和姜黃素(curcumin，Cur)能激活hPPAR γ1，而Dai、Ber、Nar、虎杖苷(polydatin，Pol)對hPPAR δ有一定程度的激活作用。 結論：1)利用pMAL-p2x表達純化體系，獲得了大量、可溶的、電泳純的MBP-hPPARsLBD和hPPARsLBD。經RBA鑒定，MBP的融合沒有影響hPPARsLBD的配體結合功能；2)HPLC-UV法為一種新的，簡便、經濟、環(huán)保、有