靶向于β淀粉樣蛋白的先導化合物篩選及其相互作用.pdf

1、阿爾茨海默?。╝lzheimerdisease，AD）是臨床常見的癡呆類型，其主要病理改變?yōu)槔夏臧吆蜕窠?jīng)元纖維纏結。β淀粉樣蛋白級聯(lián)反應假說是目前關于AD發(fā)病機制較為公認的學說，其基本觀點認為，β淀粉樣蛋白(amyloidbeta,Aβ)的沉積、聚集是AD發(fā)病的始發(fā)因素，而其他病理特征如tau蛋白的高度磷酸化以及隨后的神經(jīng)元纖維纏結等都與Aβ沉積有關。因此，從理論上講，若能找到有效且可靠的抑制Aβ聚集的試劑或藥物，將有可能減少由Aβ纖維

2、導致的神經(jīng)元變性及其他病理改變，從而抑制或阻止AD的病程發(fā)展。
　　 Aβ是一個含有40-42個氨基酸的多肽，為β淀粉樣蛋白前體蛋白的水解產(chǎn)物。生理條件下Aβ是可溶的，而在病理狀態(tài)下Aβ可在神經(jīng)組織中形成致密纖維狀的聚合體，成為不溶性的Aβ，并表現(xiàn)出神經(jīng)毒性。研究表明，不同的Aβ片段如Aβ1-40和Aβ1-42具有不同的聚集特性，而且在不同的條件下合成的Aβ纖維結構不同提示了Aβ纖維的多形性真實存在，并已通過固態(tài)核磁共振(nuc

3、learmagneticresonance，NMR)等技術得以證明。因而，探索合適的實驗環(huán)境，包括溫度的影響對于研究Aβ的特點及靶向于Aβ的藥物是十分必要的。
　　 本研究采用改良的等溫滴定微量熱（isothermaltitrationcalorimetry，ITC）、圓二色譜（circulardichroismspectra,CD）和原子力顯微鏡(atomicforcemicroscope，AFM)等方法觀察了Aβ1-40和A

4、β1-42在不同溫度下靜置、無攪拌狀態(tài)下的聚集過程，確定了穩(wěn)定的體外實驗條件。在此基礎上，利用表面等離子共振技術(surfaceplasmonresonance，SPR)對本課題組根據(jù)構效關系設計并合成的大量化合物進行了抗Aβ聚集活性的初步篩選，并以白藜蘆醇(resveratrol，RES)為代表，對部分具有Aβ抗聚集活性的化合物進行了功能確定，最后擬通過脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)腹腔注射的方法建立ICR小鼠

5、學習記憶障礙模型并研究RES對其影響。結果表明:
　　 1.4℃的實驗溫度持續(xù)24h，單體Aβ1-40和Aβ1-42均不發(fā)生熱力學改變，而25℃和37℃條件下單體Aβ1-40和Aβ1-42靜置24h內均顯示吸熱的熱力學過程;結合CD及AFM的實驗結果，提示4℃的實驗溫度下，單體Aβ1-40和Aβ1-42都不發(fā)生自我聚集，而在25℃和37℃的實驗條件下，Aβ1-40和Aβ1-42都出現(xiàn)了明顯的熱力學改變、二級結構改變和粒徑大小的改

6、變，表明25℃和37℃下Aβ1-40和Aβ1-42都可以發(fā)生自我聚集。
　　 2.利用表面等離子共振技術，首先證實了剛果紅和硫黃素S可以與單體及纖維狀Aβ1-40和Aβ1-42結合，提示表面等離子共振技術可以用于抗淀粉樣蛋白聚集化合物的初步篩選。
　　 3.通過表面等離子共振技術，待選化合物中僅有部分能與單體或纖維狀Aβ結合，但結合能力比CongoRed弱。而且相同濃度下，不同化合物與Aβ的結合能力和其與fAβ的結合能力

7、并不一致。這是否與其在聚集過程中存在二級結構改變從而暴露出不同的結合位點有關？還有待進一步研究證實。
　　 4.表面等離子共振技術證明，RES(1.56～100μM)能與單體及纖維狀Aβ結合;50μM與單體Aβ共孵后，反應體系的硫黃素T熒光強度減弱;1H-NMR結果證實RES在與單體Aβ1-42或Aβ1-40共孵過程中存在波譜變化，其中與Aβ1-42共孵后在1.05ppm和1.72ppm處出現(xiàn)新峰，而與Aβ1-40共孵后則使1.

8、17ppm處的兩個峰消失，原子力顯微鏡進一步證實共孵可使Aβ1-40和Aβ1-42自我聚集后的粒徑變小。提示RES能與單體Aβ1-40和Aβ1-42結合，干擾其自我聚集過程。
　　 5.AD人腦連續(xù)切片體外染色結果顯示，RES(10-4M)體外滴染可與腦片中的老年斑結合。
　　 6.LPS(250μg/kg)單次腹腔注射不能誘導ICR小鼠在Morris水迷宮試驗中表現(xiàn)出學習記憶能力損傷，RES(10mg/kg)灌胃給藥2

9、1天對ICR小鼠在Morris水迷宮中的表現(xiàn)無明顯影響。但是，本研究結果提示ICR小鼠能完成Morris水迷宮實驗任務，并存在性別差異，表現(xiàn)為雌性ICR小鼠在學習期找到逃生平臺的潛伏期低于雄性小鼠，記憶期則在目標象限的停留時間高于雄性小鼠。
　　 本研究結果提示，25℃可用于纖維狀Aβ1-40和Aβ1-42的體外實驗;SPR方法可有效篩選抗Aβ聚集化合物;RES可干擾Aβ1-40和Aβ1-42的自我聚集過程并與老年斑結合，但其對