D1蛋白酶的分離純化及其與抑制劑先導(dǎo)化合物的相互作用.pdf

1、藥物發(fā)現(xiàn)是藥物研發(fā)的初始階段，是人們尋找和認(rèn)識物質(zhì)藥用價值的實(shí)踐過程。藥物發(fā)現(xiàn)包括藥物分子的設(shè)計(jì)、合成、藥物靶標(biāo)的發(fā)現(xiàn)與確認(rèn)、先導(dǎo)化合物的篩選和優(yōu)化等過程。農(nóng)藥發(fā)現(xiàn)具有相似的過程，其中新型靶標(biāo)的發(fā)現(xiàn)以及基于新型靶標(biāo)的創(chuàng)新農(nóng)藥發(fā)現(xiàn)在現(xiàn)代農(nóng)藥發(fā)展過程中具有重要地位。 D1蛋白是光合作用系統(tǒng)Ⅱ核心復(fù)合體的重要組成部分，由D1蛋白前體通過D1蛋白酶(carboxyterminal processing protease of D1 pr

2、otein,CtpA)的酶切作用轉(zhuǎn)化而來，在此過程中，D1蛋白酶主要剪切D1蛋白前體羧基端延伸肽段，將D1蛋白前體轉(zhuǎn)化為成熟D1蛋白。由于當(dāng)前廣泛使用的除草劑作用靶標(biāo)是D1蛋白，而D1蛋白酶在植物體內(nèi)的含量只有D1蛋白的1％，因而D1蛋白酶被認(rèn)為是一個新型高效的除草劑作用靶標(biāo)。提取純化D1蛋白酶，并建立基于D1蛋白酶靶標(biāo)的新型抑制劑生物活性的篩選方法，對于發(fā)現(xiàn)D1蛋白酶抑制劑先導(dǎo)化合物及其結(jié)構(gòu)優(yōu)化具有重要意義。 本論文工作主要包

3、括三方面的研究內(nèi)容：1)D1蛋白酶的提取純化；2)D1蛋白酶比活力和米氏常數(shù)Km的測定；3)基于D1蛋白酶靶標(biāo)的抑制劑先導(dǎo)化合物生物活性研究。 1)．分離純化D1蛋白酶以新鮮菠菜為原料，經(jīng)過研磨、勻漿，緩沖液溶解等步驟提取葉綠體，采用超聲波破碎和緩沖液溶解獲得內(nèi)囊體膜總蛋白，通過硫酸銨鹽析沉淀得到粗蛋白酶。粗蛋白酶經(jīng)過陰離子交換和凝膠過濾柱層析進(jìn)行進(jìn)一步提純，獲得純度達(dá)到90％的D1蛋白酶。 2).D1蛋白酶比活力和米氏

4、常數(shù)Km的測定以合成的D1蛋白前體羧基端24肽作為模擬底物，采用高效液相色譜分析D1蛋白酶催化模擬底物的水解反應(yīng)，跟蹤檢測了D1蛋白酶分離提純過程各步驟獲得的D1蛋白比活力，最大比活力達(dá)到0.172nmol·mg-1·min-1；測定了D1蛋白酶對模擬底物24肽的米氏常數(shù)Km為19.6μM。 3)．基于D1蛋白酶靶標(biāo)的抑制劑先導(dǎo)化合物生物活性研究。 以菠菜D1蛋白前體的羧基端24肽為模擬底物，以高效液相色譜(HPLC)為

5、分析手段，測定了部分D1蛋白酶抑制劑先導(dǎo)結(jié)構(gòu)化合物的生物活性，建立了基于D1蛋白酶靶標(biāo)的新型抑制劑先導(dǎo)化合物生物活性研究平臺。采用的部分D1蛋白酶抑制劑先導(dǎo)結(jié)構(gòu)化合物的分子結(jié)構(gòu)如下所示： 圖1 D1蛋白酶抑制劑先導(dǎo)結(jié)構(gòu)化合物分子結(jié)構(gòu)上圖中的四個D1蛋白酶抑制劑先導(dǎo)化合物由本實(shí)驗(yàn)室通過同源模建、虛擬篩選以及化學(xué)合成得到?；诎袠?biāo)酶的生物活性測試表明，這四個化合物a1、a2、b1、b2對D1蛋白酶催化活性具有明顯的抑制作用。這些化合