μ-Calpain、Calpastatin與豬肉嫩度的關(guān)系及其基因表達(dá)的營(yíng)養(yǎng)調(diào)控研究.pdf

1、在肉的食用品質(zhì)中，肉的嫩度是消費(fèi)者最為關(guān)心和重視的性狀之一。研究顯示μ-Calpain和Calpastatin兩種蛋白與肉的嫩化密切相關(guān)。為了初步探索μ-Calpain和Calpastatin基因表達(dá)與豬肉品質(zhì)的關(guān)系，營(yíng)養(yǎng)因素對(duì)豬肉品質(zhì)(尤其是嫩度)以及對(duì)μ-Calpain和Calpastatin基因表達(dá)的作用效果及其程度，本研究在建立豬肉嫩度與μ-Calpain和calpastatin基因表達(dá)的相關(guān)關(guān)系基礎(chǔ)上，考察了營(yíng)養(yǎng)水平和MgAs

2、p對(duì)豬μ-Calpain和Calpastatin基因表達(dá)的影響，初步探明μ-Calpain和Calpastatin基因表達(dá)的營(yíng)養(yǎng)調(diào)控效果，并進(jìn)一步從分子水平上研究了鎂對(duì)μ-Calpain、Calpastatin基因表達(dá)的調(diào)控。本研究對(duì)于深入認(rèn)識(shí)豬肉肉質(zhì)性狀形成原理及營(yíng)養(yǎng)與肉質(zhì)的關(guān)系具有理論意義，對(duì)進(jìn)一步研發(fā)改善豬肉品質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)技術(shù)、促進(jìn)養(yǎng)豬生產(chǎn)具有重要指導(dǎo)意義。本研究包括以下六個(gè)試驗(yàn)： 試驗(yàn)一：考察不同品種豬肌肉中μ-Calpai

3、n和CalpastatinmRNA的表達(dá)差異，并與豬肉嫩度之間建立相關(guān)關(guān)系。選體重在80-90kg的長(zhǎng)白豬(6頭)和太湖豬(6頭)進(jìn)行屠宰。屠宰時(shí)取相同部位的骨骼肌(眼肌)用于檢測(cè)肉的嫩度及μ-Calpain和CalpastatinmRNA水平。結(jié)果表明：與長(zhǎng)白豬相比，太湖豬眼肌具有更低的剪切力(p＜0.05)，而其μ-CalpainmRNA水平極顯著高于長(zhǎng)白豬，相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)肌肉中μ-CalpainmRNA水平與剪切力呈顯著的負(fù)相關(guān)。

4、 試驗(yàn)二：考察營(yíng)養(yǎng)水平對(duì)D×L×Y育肥豬肉質(zhì)性狀及μ-Calpain、Calpastatin基因表達(dá)的影響。采用單因子試驗(yàn)設(shè)計(jì)，將24頭健康的D×L×Y雜交豬(起始重64kg左右)隨機(jī)分到2個(gè)處理，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)4頭豬。兩個(gè)處理分別飼喂高、低營(yíng)養(yǎng)水平(DE分別為13.81，12.55MJ/kg；CP分別為14，11％)的飼糧。當(dāng)體重達(dá)到100kg左右時(shí)，每個(gè)處理選6頭豬進(jìn)行屠宰取樣。測(cè)定豬的常規(guī)肉質(zhì)性狀指標(biāo)，并用實(shí)時(shí)

5、熒光定量PCR方法檢測(cè)骨骼肌μ-Calpain、Calpastatin基因mRNA的表達(dá)量。結(jié)果表明：飼喂低營(yíng)養(yǎng)水平日糧(DE=12.55MJ/kg，CP=11.08％)增加了眼肌肌內(nèi)脂肪含量，降低了眼肌的剪切力(p＜0.05)，并提高了μ-CalpainmRNA表達(dá)量(p＜0.05)。說(shuō)明營(yíng)養(yǎng)水平可以影響豬肉品質(zhì)和μ-CalpainmRNA的表達(dá)。 試驗(yàn)三：考察日糧短期添加MgAsp對(duì)試豬血液理化指標(biāo)、豬肉品質(zhì)以及眼肌μ-Ca

6、lpain和CalpastatinmRNA含量的影響。試驗(yàn)采用2×2因子試驗(yàn)設(shè)計(jì)。將24頭健康的D×L×Y雜交豬(起始重90kg左右)隨機(jī)分到對(duì)照和加鎂(1000mgMg/kg)處理。飼喂處理日糧9d后，在兩處理中隨機(jī)選6頭試豬實(shí)施運(yùn)輸應(yīng)激(1.5h)，宰前靜脈采血，屠宰所有試豬。測(cè)定試豬血液理化指標(biāo)、常規(guī)肉質(zhì)性狀指標(biāo)，并用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)眼肌μ-Calpain、Calpastatin基因mRNA的表達(dá)量。結(jié)果表明：運(yùn)輸應(yīng)激增

7、加了血清中鈣(p＜0.05)、磷(p＜0.001)、葡萄糖(p＜0.001)和皮質(zhì)醇水平(p＜0.01)，同時(shí)鎂(p=0.078)也有所增加。日糧添加MgAsp增加了血清鎂的含量(p=0.057)。運(yùn)輸應(yīng)激導(dǎo)致宰后45min(p＜0.05)和24h(p＜0.05)的眼肌L值都有所下降，并降低了眼肌45minb值(p=073)，且增加了臀肌45minpH(p＜0.05)和眼肌45minpH(p=0.098)，但運(yùn)輸使臀肌72h(p＜0.0

8、5)、眼肌24h(p＜0.01)和72h(p＜0.01)的剪切力有所提高。添加MgAsp后降低了臀肌45min(p＜0.05)和24h(p＜0.05)的L值，加鎂也降低了眼肌宰后45min的L值(p＜0.05)，并增加了臀肌45min時(shí)的a值(p＜0.05)，在數(shù)值上加鎂有降低剪切力的趨勢(shì)，但對(duì)pH值和滴水損失沒(méi)有影響。運(yùn)輸應(yīng)激增加了Calpastatin基因的表達(dá)(p＜0.05)，而添加MgAsp有提高μ-Calpain表達(dá)量的趨勢(shì)(

9、p=0.079)。這些結(jié)果表明，運(yùn)輸應(yīng)激(1.5h)提高宰后豬肉的肉色和pH值，降低嫩度；MgAsp對(duì)肉色有改善作用，有降低剪切力的趨勢(shì)，但對(duì)pH值和滴水損失沒(méi)有明顯影響。 試驗(yàn)四：在試驗(yàn)三的基礎(chǔ)上，通過(guò)添加兩個(gè)水平的MgAsp以及在宰前對(duì)豬只實(shí)施運(yùn)輸應(yīng)激，考察鎂緩解應(yīng)激及各處理對(duì)豬血液、組織生化指標(biāo)、肉品質(zhì)和肌肉中μ-Calpain、CalpastatinmRNA含量的影響程度。選用體重約88kgD×L×Y雜交豬36頭，分為三

10、組，在宰前5d分別飼喂添加不同鎂水平的日糧，處理1、2和3分別為基礎(chǔ)、1000mgMg/kg和2000mgMg/kg。每組選取一半豬只對(duì)其實(shí)施2h運(yùn)輸應(yīng)激，之后立即將所有試豬屠宰。檢測(cè)試豬血液、組織理化指標(biāo)、豬肉品質(zhì)以及用實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定試豬眼肌μ-Calpain和Calpastatin基因mRNA含量。結(jié)果表明：運(yùn)輸應(yīng)激增加了血清中鈣(p＜0.01)、葡萄糖(p＜0.01)和皮質(zhì)醇(p＜0.01)的水平，同時(shí)肌肉中cAMP(p=

11、0.09)也有所增加，運(yùn)輸降低了肌肉中糖原含量(p＜0.05)。日糧添加MgAsp增加了血清鎂(p＜0.05)，肌肉中糖原(p＜0.05)的含量，降低了血清中NOS活性(p＜0.05)。運(yùn)輸應(yīng)激導(dǎo)致眼肌24h(p＜0.05)、眼肌72h(p＜0.05)和臀肌24、72h(p＜0.05)的剪切力都有所增加，從而降低了肉的嫩度。運(yùn)輸使眼肌宰后45minpH(p＜0.01)和24hpH(p＜0.05)下降，并極顯著降低了臀肌宰后45minpH

12、。添加MgAsp有降低剪切力的趨勢(shì)，在實(shí)施運(yùn)輸應(yīng)激后，加鎂可顯著降低剪切力。添加MgAsp對(duì)肌肉pH基本無(wú)影響，可顯著降低肌肉的滴水損失，顯著增加眼肌宰后45min的a值，對(duì)眼肌宰后24h的a值也有增加的趨勢(shì)；并降低了眼肌24h(p=0.05)和臀肌24h(p=0.05)的L值。運(yùn)輸增加了Calpastatin基因的表達(dá)(p=0.05)，添加MgAsp有提高μ-Calpain表達(dá)量的趨勢(shì)。這些結(jié)果表明，運(yùn)輸應(yīng)激(2h)降低部分肉質(zhì)；Mg

13、Asp對(duì)肉色和滴水損失有改善作用，有降低剪切力的趨勢(shì)，但對(duì)pH值沒(méi)有影響。 試驗(yàn)五：利用實(shí)時(shí)定量RT-PCR、SDS-PAGE等方法研究鎂離子、腎上腺素對(duì)大鼠L6成肌細(xì)胞中μ-Calpain和CalpastatinmRNA水平以及對(duì)L6細(xì)胞內(nèi)蛋白降解程度的影響。采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)共7個(gè)處理：1-對(duì)照組；2-0.5mMMg組；3-1mMMg組；4-0.5mMMg+100ng/ml腎上腺素組；5-50ng/ml腎上腺素組；6-

14、100ng/ml腎上腺素組；7-200ng/ml腎上腺素組。結(jié)果表明：與對(duì)照組相比，添加兩種劑量的鎂離子均顯著增加成肌細(xì)胞μ-CalpainmRNA水平。此外，1mM鎂離子組還顯著增加CalpastatinmRNA水平。與對(duì)照組相比，添加腎上腺素都顯著或極顯著地增加μ-Calpain和CalpastatinmRNA水平，200ng/ml腎上腺素組的CalpastatinmRNA水平顯著高于腎上腺素50ng/ml組，而μ-Calpainm

15、RNA水平在各腎上腺素處理組沒(méi)有顯著差異。此外，0.5mM鎂離子與100ng/ml腎上腺素聯(lián)合添加組顯著增加μ-CalpainmRNA水平，對(duì)CalpastatinmRNA水平無(wú)影響。添加腎上腺素極顯著地增加細(xì)胞內(nèi)cAMP的濃度，腎上腺素100ng/ml組的cAMP濃度顯著高于腎上腺素50ng/ml組。處理3組和處理7組細(xì)胞內(nèi)蛋白降解較為明顯，而其余處理組蛋白降解無(wú)較大差異。 試驗(yàn)六：本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)體外培養(yǎng)大鼠骨骼肌成肌細(xì)胞，在添

16、加鎂離子的同時(shí)，加入μ-Calpain抑制劑-E64，在定量檢測(cè)μ-Calpain基因mRNA水平基礎(chǔ)上進(jìn)一步檢測(cè)μ-Calpain及其底物蛋白Nebulin亞片段表達(dá)量的變化。從而進(jìn)一步研究鎂離子與μ-Calpain的表達(dá)、肌肉蛋白降解以及與肉品質(zhì)的關(guān)系。試驗(yàn)設(shè)4個(gè)處理：1-對(duì)照組；2-加鎂組；3-E64組；4-加鎂+E64組。其中鎂的處理濃度為1.0mM.；E64的處理濃度為10μM。結(jié)果表明：培養(yǎng)液中添加1mM鎂離子可顯著增加μ-

17、CalpainmRNA水平，并顯著增加μ-Calpain的蛋白量，并有增加Nebulin蛋白200kDa亞片段的趨勢(shì)(p=0.096)；培養(yǎng)液中添加E64極顯著地降低Nebulin蛋白200kDa亞片段的量。 綜上所述，本研究結(jié)果表明： 1)μ-Calpain、Calpastatin基因與豬肉嫩度密切相關(guān)。μ-Calpain基因表達(dá)增加提高豬肉嫩度；Calpastatin基因表達(dá)增加降低豬肉嫩度。 2)μ-Cal